A luz - e todas as ondas - podem contornar os cantos dos obstáculos encontrados ao longo de seu caminho. Por causa desse fenômeno, chamado difração, é impossível focalizar a luz em um ponto menor que a metade de seu comprimento de onda. Em outras palavras, a resolução mais alta que se pode atingir teoricamente usando um microscópio óptico é de aproximadamente 250 nm, uma barreira chamada limite de difração. Infelizmente, esta resolução não é suficiente para observar estruturas celulares finas, como os encontrados em neurônios.

Por mais de um século, os microscopistas foram prejudicados por essa barreira clássica até a invenção da microscopia de fluorescência de super-resolução. Uma abordagem particularmente poderosa foi desenvolvida no final da década de 1990 e cunhou a microscopia de 'depleção de emissão estimulada' (STED). Esta técnica requer que a amostra alvo contenha fluoróforos, que são compostos que absorvem luz em um comprimento de onda e a reemitem em um comprimento de onda mais longo. Na versão mais simples da microscopia STED, os fluoróforos são excitados em um ponto circular por irradiação com um laser focalizado por difração limitada. Então, uma porção em forma de donut ao redor do ponto é irradiada com luz menos energética - o feixe de depleção - que desliga a fluorescência pelo processo de emissão estimulada. Assim, o efeito líquido é que apenas os fluoróforos no centro do donut reemitem fótons. Como essa área pode ser arbitrariamente pequena, isso permite microscopia de super-resolução.

Embora a microscopia STED tenha sido um verdadeiro avanço para observar a morfologia dos neurônios vivos em resolução mais alta, ainda há espaço para melhorias. Em um estudo recente publicado em Neurophotonics , uma equipe de cientistas liderada pelo Dr. U. Valentin Nägerl da Université de Bordeaux desenvolveu um método de calibração simples, mas eficaz, que permite imagens STED mais precisas em maiores profundidades de tecido. Sua abordagem é baseada na análise e correção de uma das principais fontes de erro sistemático na microscopia STED para amostras biológicas:a aberração esférica do feixe de depleção.

Ao obter imagens de uma amostra de tecido em profundidades superiores a 40μm, o feixe de depleção sofre vários tipos de desfocagem e degradação (aberração) e perde sua forma cuidadosamente elaborada, que é essencial para o método STED. A aberração esférica é o maior agressor e foi o alvo dos pesquisadores. A estratégia deles era preparar primeiro uma amostra fantasma de tecido cerebral, um proxy baseado em gel com um índice de refração semelhante ao do cérebro real. Esta amostra fantasma continha fluoróforos homogeneamente dispersos e nanopartículas de ouro, o que permitiu à equipe visualizar e quantificar claramente como a forma do feixe de depleção foi distorcida à medida que penetrava mais profundamente. Então, calcularam os pré-ajustes necessários que devem ser feitos ao feixe de depleção de acordo com a profundidade do tecido para que sua forma final se aproxime mais da ideal. Os ajustes foram feitos usando óptica adaptativa, que é uma tecnologia desenvolvida originalmente por astrônomos para melhorar as imagens telescópicas que sofrem com as aberrações causadas pela atmosfera terrestre.

Uma vez que a forma do feixe de depleção foi calibrada de acordo com os testes fantasmas, os cientistas começaram a criar imagens de tecido neural vivo. Eles compararam os resultados da microscopia STED regular, microscopia STED corrigida, e microscopia de dois fótons - uma técnica que é ajustada especificamente para imagens de tecidos profundos. Os resultados foram bastante convincentes:as imagens STED corrigidas capturaram os detalhes de dendritos neurais mais profundos muito melhor do que as imagens STED padrão. "Usando nossa estratégia de calibração, poderíamos medir estruturas neuronais tão pequenas quanto 80 nm a uma profundidade de 90 μm dentro do tecido biológico e obter um aumento de sinal de 60 por cento após a correção da aberração esférica, "diz Nägerl.

Ji Yi, professor de engenharia biomédica da Universidade Johns Hopkins comenta que "a microscopia de super-resolução tem sido aplicada principalmente para espécimes finos, como células de camada única, onde a dispersão de luz é insignificante. A equipe liderada por Valentin Nägerl implementou óptica adaptativa em uma microscopia de depleção de emissão estimulada por dois fótons (2P-STED), e alcançou resolução de 80 nm de espinhas dendríticas de neurônios de imagem através de tecido cerebral de 90 mícrons. Isso é digno de nota porque a super-resolução é difícil de manter em tecidos mais espessos - principalmente devido à alta qualidade de dispersão do tecido cerebral. "Yi explica que o avanço facilitará o estudo das atividades e interações neurais.

Considerando que este novo processo de calibração é robusto, simples de implementar, e relativamente barato, poderia ser facilmente incorporado nas práticas de laboratório padrão para obter melhores resultados com microscópios STED, desde que a amostra fantasma preparada corresponda às propriedades ópticas do espécime biológico. A respeito disso, Nägerl afirma, "nossa abordagem não se limita a amostras de cérebro; ela poderia ser adaptada a outros tecidos com índices de refração conhecidos e relativamente homogêneos, bem como outros tipos de preparações, mesmo potencialmente intacto, cérebro de rato vivo. "