Os pesquisadores desenvolveram uma nova técnica de microscopia que pode adquirir imagens de super-resolução 3-D de estruturas subcelulares de cerca de 100 mícrons de profundidade no tecido biológico, incluindo o cérebro. Ao dar aos cientistas uma visão mais profunda do cérebro, o método pode ajudar a revelar mudanças sutis que ocorrem nos neurônios ao longo do tempo, durante a aprendizagem, ou como resultado de doença.

A nova abordagem é uma extensão da microscopia de depleção de emissão estimulada (STED), uma técnica inovadora que atinge resolução em nanoescala ao superar o limite de difração tradicional dos microscópios ópticos. Stefan Hell ganhou o Prêmio Nobel de Química de 2014 por desenvolver esta técnica de imagem de super-resolução.

No Optica , os pesquisadores descrevem como usaram seu novo microscópio STED para obter imagens, em super-resolução, a estrutura 3-D das espinhas dendríticas nas profundezas do cérebro de um camundongo vivo. As espinhas dendríticas são pequenas protuberâncias nos ramos dendríticos dos neurônios, que recebem entradas sinápticas de neurônios vizinhos. Eles desempenham um papel crucial na atividade neuronal.

"Nosso microscópio é o primeiro instrumento no mundo a alcançar super-resolução 3-D STED bem no fundo de um animal vivo, "disse o líder da equipe de pesquisa Joerg Bewersdorf da Yale School of Medicine." Esses avanços na tecnologia de imagem de tecido profundo permitirão aos pesquisadores visualizar diretamente as estruturas subcelulares e a dinâmica em seu ambiente de tecido nativo, "disse Bewersdorf." A capacidade de estudar o comportamento celular desta forma é crítica para obter uma compreensão abrangente dos fenômenos biológicos para a pesquisa biomédica, bem como para o desenvolvimento farmacêutico. "

Indo mais fundo

A microscopia STED convencional é mais frequentemente usada para obter imagens de amostras de células em cultura. Usar a técnica para criar imagens de tecidos espessos ou animais vivos é muito mais desafiador, especialmente quando os benefícios de super-resolução do STED são estendidos para a terceira dimensão para 3-D-STED. Essa limitação ocorre porque o tecido espesso e opticamente denso impede que a luz penetre profundamente e se concentre de forma adequada, prejudicando assim as capacidades de super-resolução do microscópio STED.

Para superar este desafio, os pesquisadores combinaram microscopia STED com excitação de dois fótons (2PE) e óptica adaptativa. "2PE permite imagens mais profundas no tecido usando comprimentos de onda do infravermelho próximo em vez de luz visível, "disse Mary Grace M. Velasco, primeiro autor do artigo. "A luz infravermelha é menos suscetível a dispersão e, Portanto, é mais capaz de penetrar profundamente no tecido. "

Os pesquisadores também adicionaram óptica adaptativa ao seu sistema. "O uso de óptica adaptativa corrige distorções na forma da luz, ou seja, as aberrações ópticas, que surgem ao obter imagens no e através do tecido, "disse Velasco." Durante a imagem, o elemento adaptativo modifica a frente de onda da luz da maneira exatamente oposta que o tecido na amostra faz. As aberrações do elemento adaptativo, Portanto, cancela as aberrações do tecido, criando condições ideais de imagem que permitem que os recursos de super-resolução STED sejam recuperados em todas as três dimensões. "

Vendo mudanças no cérebro

Os pesquisadores testaram sua técnica 3-D-2PE-STED pela primeira vez em imagens de estruturas bem caracterizadas em células cultivadas em uma lamínula. Comparado ao uso de 2PE sozinho, 3-D-2PE-STED resolveu volumes mais de 10 vezes menores. Eles também mostraram que seu microscópio pode resolver a distribuição de DNA no núcleo das células da pele de camundongos muito melhor do que um microscópio convencional de dois fótons.

Após esses testes, os pesquisadores usaram seu microscópio 3-D-2PE-STED para obter imagens do cérebro de um camundongo vivo. Eles ampliaram parte de um dendrito e resolveram a estrutura 3-D de espinhos individuais. Eles então fotografaram a mesma área dois dias depois e mostraram que a estrutura da coluna realmente havia mudado durante esse tempo. Os pesquisadores não observaram nenhuma mudança na estrutura dos neurônios em suas imagens ou no comportamento dos camundongos que pudesse indicar danos nas imagens. Contudo, eles planejam estudar isso mais a fundo.

"Os espinhos dendríticos são tão pequenos que, sem super-resolução, é difícil visualizar sua forma 3D exata, muito menos quaisquer mudanças neste formato ao longo do tempo, "disse Velasco." 3-D-2PE-STED agora fornece os meios para observar essas mudanças e fazer isso não apenas nas camadas superficiais do cérebro, mas também mais profundamente dentro, onde mais conexões interessantes acontecem. "