Pesquisadores da Unidade QWM, O Dr. Hidehito Adaniya (à esquerda) e o Dr. Martin Cheung (à direita) mostram o novo microscópio crioeletrônico. Crédito:Instituto de Ciência e Tecnologia de Okinawa
Visualizando a estrutura dos vírus, proteínas e outras pequenas biomoléculas podem ajudar os cientistas a obter percepções mais profundas sobre como essas moléculas funcionam, potencialmente levando a novos tratamentos para doenças. Nos últimos anos, uma tecnologia poderosa chamada microscopia eletrônica criogênica (cryo-EM), onde amostras congeladas são incorporadas em gelo semelhante a vidro e sondadas por um feixe de elétrons, revolucionou a imagem de biomoléculas. Contudo, os microscópios nos quais a técnica depende são proibitivamente caros e complicados de usar, tornando-os inacessíveis a muitos pesquisadores.
Agora, cientistas da Universidade de Pós-Graduação do Instituto de Ciência e Tecnologia de Okinawa (OIST) desenvolveram um microscópio crioeletrônico mais barato e fácil de usar, o que poderia, em última instância, colocar o crio-EM ao alcance de milhares de laboratórios.
Em um processo de construção de seis anos, a equipe construiu o microscópio adicionando uma nova função de imagem a um microscópio eletrônico de varredura. Eles usaram o microscópio híbrido para obter imagens de três biomoléculas diferentes:dois vírus de formas distintas e uma proteína de minhoca.
"Construir este microscópio foi um processo longo e desafiador, por isso, estamos entusiasmados com os resultados até agora, "disse o Dr. Hidehito Adaniya, um pesquisador da Unidade de Microscopia de Onda Quântica (QWM) e co-primeiro autor do estudo, publicado em Ultramicroscopia . "Além de ser mais barato e simples de usar, nosso microscópio utiliza elétrons de baixa energia, o que pode melhorar potencialmente o contraste das imagens. "
Atualmente, cryo-EM funciona disparando elétrons de alta energia em um espécime biológico. Os elétrons interagem com átomos na biomolécula e se espalham, mudando sua direção. Os elétrons espalhados então atingem os detectores, e o padrão de dispersão específico é usado para construir uma imagem da amostra.
Os dois modos convencionais de um microscópio eletrônico de varredura (MEV e STEM; esquerdo e centro) não foram capazes de gerar imagens das biomoléculas. Contudo, modo de imagem holográfica (direita), pode ser usado para imagens de biomoléculas, como o vírus do mosaico do tabaco mostrado. Crédito:Modificado de M Cheung, H Adaniya, C Cassidy, M Yamashita, T Shintake. Imagem holográfica eletrônica em linha de baixa energia de pequenas biomoléculas incrustadas em gelo vítreo usando um microscópio eletrônico de varredura modificado. Ultramicroscopia, 209 (2020) 112883, Fig 3.
Mas em altas energias, apenas um número relativamente pequeno desses eventos de espalhamento ocorre porque os elétrons interagem muito fracamente com os átomos na amostra à medida que passam em alta velocidade.
"As biomoléculas são compostas predominantemente por elementos com baixa massa atômica, como carbono, azoto, hidrogênio e oxigênio, "explicou o co-autor e pesquisador, Dr. Martin Cheung. "Esses elementos mais leves são praticamente invisíveis para os elétrons de alta velocidade."
Em contraste, elétrons de baixa energia viajam mais devagar e interagem mais fortemente com os elementos mais leves, criando eventos de dispersão mais frequentes.
Esta forte interação entre elétrons de baixa energia e elementos mais leves é um desafio de aproveitar, Contudo, porque a camada de gelo ao redor do espécime também espalha elétrons, criando ruído de fundo que mascara as biomoléculas. Para superar esse problema, os cientistas adaptaram o microscópio para que pudesse mudar para uma técnica de imagem diferente:holografia crioeletrônica.
No modo de imagem holográfica, o feixe de elétrons abrange toda a amostra, formando uma onda de referência e uma onda de objeto. Essas ondas, então, interferem umas com as outras para formar um holograma, que é registrado por um detector. Crédito:Modificado de M Cheung, H Adaniya, C Cassidy, M Yamashita, T Shintake. Imagem holográfica eletrônica em linha de baixa energia de pequenas biomoléculas incrustadas em gelo vítreo usando um microscópio eletrônico de varredura modificado. Ultramicroscopia, 209 (2020) 112883, Figura 2.
Formando o holograma
No modo holográfico, um canhão de elétrons dispara um feixe de elétrons de baixa energia em direção ao espécime de modo que parte do feixe de elétrons atravesse o gelo e o espécime, formando uma onda de objeto, enquanto a outra parte do feixe de elétrons só passa pelo gelo, formando uma onda de referência. As duas partes do feixe de elétrons, então, interagem entre si, como ondas colidindo em uma lagoa, criando um padrão distinto de interferência - o holograma.
Com base no padrão de interferência do holograma, os detectores podem distinguir o espalhamento pelo espécime do espalhamento pelo filme de gelo. Os cientistas também podem comparar as duas partes do feixe para obter informações extras dos elétrons que são difíceis de detectar usando crio-EM convencional.
"A holografia de elétrons nos fornece dois tipos diferentes de informações - amplitude e fase - enquanto as técnicas convencionais de microscopia crioeletrônica podem detectar apenas a fase, "disse o Dr. Adaniya. Esta informação adicional poderia permitir aos cientistas obter mais conhecimento sobre a estrutura do espécime, ele explicou.
O gelo cristalino se forma quando o vapor de água atmosférico esfria e cristaliza ao entrar em contato com a amostra super-resfriada. Os pesquisadores, portanto, devem realizar o procedimento de preparação em um porta-luvas cheio de nitrogênio para evitar o contato com a água. Crédito:Instituto de Ciência e Tecnologia de Okinawa
Uma descoberta em gelo fino
Além de construir o microscópio híbrido, os cientistas também tiveram que otimizar a preparação da amostra. Uma vez que os elétrons de baixa energia são mais propensos a serem espalhados pelo gelo do que os elétrons de alta energia, o filme de gelo que envolve a amostra deve ser o mais fino possível para maximizar o sinal. Os cientistas usaram flocos de óxido de grafeno hidratado para manter as biomoléculas no lugar, permitindo a formação de filmes mais finos de gelo.
Os cientistas também tiveram que tomar medidas especiais para evitar a formação de gelo cristalino, que são "más notícias para imagens crio-EM, "Cheung disse.
Com as amostras atuais configuradas e otimizadas, o microscópio produziu imagens com resolução de até alguns nanômetros, que os pesquisadores reconhecem ser muito menor do que a resolução quase atômica alcançada pelo crio-EM convencional.
Mas mesmo com a resolução atual, o microscópio ainda preenche um nicho importante como microscópio de pré-triagem. "Como os elétrons de baixa energia interagem fortemente com o gelo, nosso microscópio mais barato e fácil de usar pode ajudar os pesquisadores a avaliar a qualidade do gelo antes de gastar tempo e dinheiro valiosos usando microscópios crio-EM convencionais, "disse o Dr. Adaniya.
Todo o processo é rápido e simples, dizem os pesquisadores. O modo SEM / STEM ajuda os cientistas a localizar o melhor local para imagens, seguido por uma transição contínua para o modo holográfico. O que mais, a capacidade dessa tecnologia de comutação de modo ser implementada em outros microscópios eletrônicos de varredura comerciais torna-a um método de imagem amplamente adotável.
No futuro, a equipe espera melhorar ainda mais a resolução da imagem, mudando o canhão de elétrons para um que crie um feixe de elétrons de maior qualidade. "Esse será o próximo passo em frente, " eles disseram.