Representação esquemática do sistema de microscopia híbrida contendo um subsistema para microscopia optoacústica de comprimento de onda duplo em 488 nm e 808 nm, co-alinhado com um subsistema para microscopia multifotônica em 1043 nm. a) amplificador AMP, Câmera CCD de campo claro, Cartão de aquisição de dados DAQ, Espelho dicróico DM, Controlador de espelho galvanométrico GC, Desmodulador IQD IQ, LO1 oscilador local 1, LO2 oscilador local 2, Filtros de densidade neutra NDF, OA optoacústico, OF filtro óptico, Computador pessoal PC, PH pinhole, Tubo fotomultiplicador PMT, Geração de segundo harmônico SHG, Geração de terceiro harmônico THG, Fluorescência de excitação de dois fótons TPEF, estágios motorizados xyz. b) O espectro dos comprimentos de onda de excitação e detecção na imagem híbrida FDOM / multifotônica (MP). c) Comparação esquemática entre microscopia optoacústica no domínio do tempo (TD), que usa pulsos curtos de luz, e microscopia optoacústica no domínio da frequência (FD), que é baseado na intensidade do laser modulada em várias frequências discretas. Crédito: Light:Ciência e Aplicações . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Imagens optoacústicas alimentadas por rajadas curtas de lasers de onda contínua (CW) podem estimular a emissão de ondas de ultrassom dentro de um animal ou em seres humanos. O método pode capturar de forma não invasiva o fluxo sanguíneo e produzir imagens 3-D da microarquitetura celular. Escrevendo em Light:Ciência e Aplicações , Stephan Kellnberger e colegas do Institute of Biological and Medical Imaging, agora relatam a possibilidade de obter imagens optoacústicas de alta fidelidade com lasers econômicos controlados em múltiplas frequências.
Os autores demonstraram experimentalmente os múltiplos baseados em frequência, geração de imagem de alta fidelidade de arquitetura biológica por imagem de microvasculatura de tecido de peixe e camundongo. Nos experimentos de imagem, eles sobrepunham detalhes estruturais que só apareciam em frequências de interesse específicas. Os autores também identificaram de forma não invasiva a velocidade do fluxo sanguíneo na microvasculatura do tecido, rastreando as mudanças de frequência usando o efeito Doppler optoacústico.
A detecção optoacústica (fotoacústica) geralmente requer tecnologias de laser complexas. Essas técnicas podem gerar comprimento de nanossegundos (1-100 ns), pulsos de fótons curtos de alta energia que convencionalmente iluminam energia transiente (de vida curta) no domínio do tempo (TD). Os pulsos ultracurtos podem estimular a emissão de ondas ultrassônicas de banda larga, coletados na faixa de microssegundos para formar imagens optoacústicas. Contudo, a tecnologia de laser complexa pode impor uma frequência de repetição de pulso baixo (PRF) e limitar o número de comprimentos de onda disponíveis simultaneamente para imagens espectrais. Para evitar tais limites, Kellnberger et al. desenvolveu microscopia optoacústica de domínio de frequência (FDOM), em que a intensidade da luz pode ser controlada ou modulada em várias frequências discretas usando hardware de baixo custo.
Explicação da codificação de frequência em FDOM de comprimento de onda duplo. a) Esquema simplificado de codificação de frequência em diferentes comprimentos de onda. A fonte de laser 1 que emite em λ1 =488 nm foi carregada com a frequência de modulação mais baixa f1, enquanto a fonte de laser 2 que emite em λ2 =808 nm foi carregada com a fend de frequência de modulação mais alta. Durante a imagem, aumentamos a modulação do comprimento de onda λ1 e diminuímos a frequência de modulação de λ2 em etapas de fstep usando números ímpares de frequências de modulação. b) Representação esquemática de múltiplas frequências de modulação usadas para geração de imagens, mostrando a superposição de frequências em dois comprimentos de onda. Crédito: Light:Ciência e Aplicações . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Até agora, a imagem optoacústica tem se baseado apenas em técnicas que detectam sinais no domínio do tempo (TD) ou aquelas que varrem apenas uma única frequência em um ou dois comprimentos de onda no domínio da frequência (FD). O presente estudo foi o primeiro a conduzir imagens optoacústicas in vivo em um modelo animal por meio de iluminação simultânea com dois comprimentos de onda.
Os cientistas combinaram o FDOM em um sistema híbrido para examinar a relação entre a formação da imagem e o controle de frequência. O uso de frequências discretas (no máximo nove), permitiu medições de deslocamento Doppler optoacústicas não invasivas como observações de fluxo em uma câmara de fluxo microfluídico no laboratório primeiro, e posteriormente na microvasculatura do tecido in vivo. No estudo, Kellnberger et al. usou dois lasers de diodo CW emitindo luz a 488 nm e 808 nm para iluminação.
Os cientistas implementaram o FDOM, operando na faixa de frequência de 5-50 MHz, como um sistema híbrido com microscopia multifotônica (MP) operando em 1043 nm. Eles então realizaram imagens bidimensionais / tridimensionais com base na amplitude do ultrassom e medições de fase em várias frequências. A amplitude e a fase dos sinais optoacústicos gerados foram resolvidos via demodulação em tempo real e registrados por meio de um conversor analógico-digital. Devido às altas taxas de repetição, o FDOM alcançou altas taxas de sinal-ruído (SNR), levando às imagens de alta fidelidade observadas. No total, o estudo examinou a relação entre a frequência de modulação, fidelidade de imagem e relação sinal-ruído (SNR).
Imagem FDOM de comprimento de onda único de uma sutura e amostras de peixe-zebra ex vivo. a) Uma ilustração esquemática da digitalização de duas suturas cruzadas. b) Imagens FDOM codificadas por cores de duas suturas de 50 µm, com base na iluminação a 488 nm e frequências de modulação de 10, 20, 30, e 40 MHz. A representação do espaço de frequência de cor (FSR) sobrepõe as contribuições de cada frequência de modulação. A imagem FSR em tons de cinza com base em quatro frequências mostra a imagem final. c) Perfil transversal da linha tracejada mostrada no painel b, que compara os contrastes revelados pelas várias frequências de modulação. d) Imagem ex vivo de um globo ocular de larva de peixe-zebra. A imagem roxa foi reconstruída usando frequências baixas (L) (10, 15, e 20 MHz); a imagem verde usando frequências médias (M) (25, 30, e 35 MHz); e a imagem vermelha usando altas (H) frequências (40, 45, e 50 MHz). A sobreposição codificada por cores de todas as frequências (FSR, 10 a 50 MHz) destaca a contribuição de cada região espectral. e) A cor laranja representa a soma da amplitude para as nove frequências de modulação empregadas. f) Uma imagem de campo claro de um olho de peixe-zebra, validar a fidelidade das imagens FDOM. g) Uma comparação das relações sinal-ruído (SNRs) de imagens de duas suturas cruzadas (40 µm de diâmetro) obtidas por microscopia optoacústica FD e TD. A imagem FDOM rendeu um SNR de ~ 35 dB. h) Em configurações experimentais semelhantes, A microscopia TD resultou em um SNR de ~ 29 dB. Crédito: Light:Ciência e Aplicações . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Para identificar as características da imagem fotoacústica FD, os cientistas fotografaram um par de suturas cruzadas na água em dois comprimentos de onda (488 nm e 808 nm) e frequências de modulação discretas. A sobreposição de várias contribuições de frequência carregava informações do objeto imageado (suturas).
Para extrair informações de estruturas mais complexas, Kellnberger et al. fotografou o olho de lava do peixe-zebra de tipo selvagem de 5 dias ex vivo, usando nove frequências de modulação abrangendo 10-50 MHz em etapas de 5 MHz. Os cientistas também compararam o SNR (relação sinal-ruído) entre o método FDOM e o TD convencional, que variou de acordo com os parâmetros experimentais (energia do laser, potência empregada e hardware de aquisição de dados).
Os dados de amplitude e fase multifrequenciais podem, portanto, ser processados para reconstrução de imagem 3-D usando uma transformada de Fourier com base na representação espaço-freqüência (FSR) e representação espaço-tempo (TSR). Comparado com TSR, a reconstrução de imagem baseada em FSR foi computacionalmente mais rápida e não exigiu inversão de dados durante a reconstrução de imagem.
Imagem FDOM de comprimento de onda único e duplo de uma orelha de rato in vivo. a) Imagem FDOM em 488 nm. A cor ciano representa a imagem reconstruída, de nove frequências igualmente espaçadas na faixa de 10 a 50 MHz. b – d) Imagens individuais obtidas em frequências de modulação de 10, 30, e 50 MHz, que representam as estruturas na caixa tracejada no painel a. e) SNR em função de n frequências que foram utilizadas para reconstrução FSR. Uma melhora assintótica é observada para n> 8 frequências discretas. f) Uma vista de perfil da caixa tracejada no painel a, que é delineado por uma seta branca tracejada. Ele demonstra a relação entre a frequência de modulação e a resolução da imagem. As cruzes amarelas destacam a resolução da imagem em função da frequência de modulação:a modulação mais rápida (50 MHz) pode resolver claramente pequenas estruturas, mesmo abaixo de 4 µm, enquanto a modulação mais lenta (10 MHz) não. g – l) Imagem híbrida FDOM / multifotônica de uma orelha de camundongo após a injeção de células de melanoma. g) Uma imagem de sobreposição que foi obtida usando quatro modalidades de microscopia sem etiqueta:FDOM em 488 nm e 808 nm, SHG a 522 nm, e THG a 348 nm. h) Uma imagem de campo claro validando os resultados obtidos por meio de microscopia híbrida; MC, células de melanoma. i) Imagem FDOM em 488 nm mostrando vasculatura e células de melanoma. j) Uma imagem FDOM em 808 nm que mostra células de melanoma B16F10 injetadas na orelha de camundongo. k) Uma imagem SHG mostrando a distribuição do colágeno na epiderme. l) Uma imagem THG que mostra a morfologia do tecido; predominantemente queratinócitos e folículos pilosos. Crédito: Light:Ciência e Aplicações . Doi:https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Para imagens de tecido in vivo baseadas em FDOM, os cientistas observaram a orelha de um camundongo anestesiado. Eles obtiveram imagens livres de artefatos com múltiplas frequências de modulação que combinavam com as frequências espaciais do objeto de imagem. Os cientistas usaram no máximo nove frequências no estudo. O SNR da imagem aumentou de ~ 14 dB em uma única frequência para ~ 30 dB em nove frequências para imagens mais nítidas.
Eles então observaram uma orelha de rato contendo células de melanoma metastático murino in vivo, como antes, por meio de excitação sincronizada de dois comprimentos de onda (488 nm e 808 nm) em frequências de modulação separadas. Usando microscopia óptica e optoacústica combinada, Kellnberger e colegas de trabalho foram capazes de obter imagens de forma eficiente das características do tecido (ou seja, vasculatura, células de melanoma, colágeno e queratinócitos) sem marcadores ou rótulos fluorescentes convencionais.
Kellnberger et al. em seguida, realizou medições FD micro-Doppler (µDoppler) com a configuração pela primeira vez em uma orelha de camundongo para imagens optoacústicas do fluxo sanguíneo microcirculatório in vivo. Antes de realizar as medições pretendidas, os cientistas usaram partículas de carbono negro em taxas de fluxo variáveis de circulação em um chip microfluídico para validar a configuração experimental. O µDoppler FDOM foi empregado para gerar um mapa da microcirculação na orelha de um camundongo. O fluxo sanguíneo microcirculatório revelou um aumento gradual da velocidade da borda do vaso até o núcleo.
Imagem optoacústica do fluxo sanguíneo microcirculatório em uma orelha de camundongo in vivo. a Um esquema da configuração de detecção do µDoppler. FL1− fluxo 1 longe do sensor dos EUA, FL2− fluxo 2 longe do sensor dos EUA (FL2−
Desta maneira, o estudo demonstrou o uso de microscopia optoacústica no domínio da frequência (FDOM) com base na detecção e demodulação de sinal pela primeira vez. Os cientistas capturaram sinais de amplitude e fase em várias frequências do objeto de imagem. A configuração experimental coletiva continha fontes de luz baratas, iluminação simultânea de vários comprimentos de onda e medições diretas de fluxo baseadas em Doppler. Em estudos futuros, Kellnberger et al. irá quantificar as frequências de modulação, a profundidade da imagem e aumente a resolução da imagem usando uma configuração experimental aprimorada.
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