Por Pete Collins | Atualizado em 30 de agosto de 2022

TL;DR

A eletroforese separa macromoléculas, como proteínas e ácidos nucléicos, por tamanho, carga e outras propriedades físico-químicas. Nas separações baseadas em carga, uma solução tampão transmite o campo elétrico e mantém um pH estável, preservando a carga nativa e a estrutura dos analitos. Essa estabilidade é crítica para uma resolução precisa.

Princípios de Eletroforese

A eletroforese aproveita um campo elétrico aplicado (ou um gradiente químico em técnicas especializadas) para mover moléculas carregadas através de uma matriz de gel. As moléculas migram em direção ao eletrodo de carga oposta:espécies com carga negativa viajam para o ânodo, espécies com carga positiva para o cátodo. Como as moléculas maiores sofrem mais fricção dentro do gel, elas se movem mais lentamente do que as menores, permitindo a separação baseada no tamanho. A distância migrada pode ser plotada em escala logarítmica para estimar o peso molecular ou o comprimento do fragmento.

Eletroforese em Gel Gradiente Desnaturante (DGGE)

DGGE introduz um gradiente desnaturante – normalmente uma mistura de uréia e formamida – dentro do gel. À medida que os fragmentos de DNA atravessam o gradiente, o aumento das concentrações de desnaturante desestabiliza progressivamente a dupla hélice. Cada fragmento para de migrar quando a concentração local do desnaturante atinge o seu ponto de fusão. Esta técnica explora o comportamento de fusão dependente da sequência para resolver fragmentos de DNA de comprimento idêntico, mas de sequência diferente.

O que o buffer faz

Na eletroforese baseada em carga, as espécies iônicas do tampão conduzem o campo elétrico aplicado através do gel, garantindo uma distribuição uniforme da corrente. Simultaneamente, o par ácido-base fraco do tampão mantém o pH dentro de uma janela estreita. Como o estado de carga e a estrutura tridimensional das proteínas e dos ácidos nucleicos dependem do pH, um pH estável evita alterações conformacionais não intencionais que poderiam comprometer a fidelidade da separação.

Buffers típicos

A escolha do tampão certo depende da faixa de pH desejada e da necessidade de minimizar a força iônica, que poderia gerar calor excessivo e distorção. Os buffers comumente usados incluem:

• Ácido acético (pKa 4,76) – ideal para separações de baixo pH.
• Ácido bórico (pKa 9,24) – frequentemente usado em ensaios baseados em DNA.
• Ácido fosfórico (pKa 2,15, 7,20, 12,32) – versátil para um amplo espectro de pH.
• Ácido cítrico (pKa 3,13, 4,76, 5,49) – fornece tamponamento na faixa de pH 3–6.
• Glicina (pKa 2,34, 9,60) – comum em sistemas Tris-glicina.
• Taurina (pKa 1,71) – usado em protocolos eletroforéticos especializados.

Para um desempenho ideal, o pKa do buffer deve estar próximo do pH alvo e a força iônica geral deve ser baixa o suficiente para limitar o aquecimento induzido por corrente e, ao mesmo tempo, permitir uma transferência de carga eficiente.

Ao selecionar e manter cuidadosamente as condições tampão, os pesquisadores podem obter separações reproduzíveis e de alta resolução, essenciais para análises posteriores.