As técnicas de nêutrons são boas para estudar átomos leves como o hidrogênio - ótimas para moléculas biológicas que contêm um grande número deles. Os nêutrons são particularmente sensíveis à substituição isotópica de hidrogênio (1H) por deutério (2H) e isso permite que técnicas de contraste sejam usadas para estudar moléculas em detalhes. Por esta, os usuários precisam preparar versões deuteradas das moléculas biológicas que desejam estudar. Contudo, essas moléculas per-deuteradas raramente estão disponíveis em fornecedores comerciais porque o mercado para elas é de valor limitado. Aqui, o SINE2020 visa preencher a lacuna.

A tarefa 5.2 do pacote de trabalho de Deuteração Química é configurar procedimentos para extração, purificação e análise de biomoléculas pequenas deuteradas. Essas moléculas estarão então disponíveis para usuários de técnicas de nêutrons e por meio dos parceiros da plataforma DEUNET. As principais biomoléculas envolvidas são os fosfolipídios, esteróis (por exemplo, colesterol) e esfingolipídios - todos os tipos de moléculas que podem ser encontrados em membranas biológicas e, portanto, têm aplicações importantes em produtos farmacêuticos. Os lipídios também têm papéis nos cosméticos, setores de alimentos e nanotecnologia, portanto, a capacidade de estudá-los usando nêutrons seria inestimável para muitos pesquisadores e empresas industriais.

Krishna Batchu, com Giovanna Fragneto, no ILL realiza pesquisas para o SINE2020. O trabalho se concentrou em vários fosfolipídios que incluem principalmente fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilcolina (PC) e fosfatidilserina (PS). Eles são preparados usando culturas de células da cepa de levedura Pichia pastoris, pois funciona bem para a extração de lipídios e cresce com sucesso em meio deuterado.

Fosfolipídios são moléculas anfipáticas que consistem em um grupo de cabeças que amam a água e duas "pernas" que odeiam a água. As "pernas" são cadeias de átomos de carbono ligadas ao hidrogênio (ou átomos de deutério). Suas composições nas membranas celulares são enormemente complexas com membranas tipicamente compreendendo vários milhares de espécies moleculares quimicamente distintas de lipídios. As cadeias dentro podem variar em comprimento, geralmente entre 6 e 24 átomos de carbono, e contêm entre 0 e 12 ligações duplas entre os átomos de carbono - o chamado nível de saturação. Quanto mais ligações duplas, quanto mais insaturada a cadeia.

A homeostase dos fosfolipídios em um sistema biológico é mantida por meio de três processos celulares principais:1) Biossíntese 2) Remodelação e 3) Degradação. Nas células de levedura (na cultura) existe uma maquinaria molecular dedicada ao metabolismo dos ácidos graxos, causando alongamento e insaturação da cadeia, catalisado por elongases e dessaturases, respectivamente, durante o processo de produção. Uma vez biossintetizado, sua incorporação em vários fosfolipídios é catalisada por uma série de aciltransferases, levando à existência de um repertório maior de espécies moleculares individuais. O desafio é que, com tantas variáveis, o número de tipos de fosfolipídios produzidos é vasto.

Parte do projeto estudou como as condições de crescimento afetam o tipo de lipídios produzidos. Não foram encontradas diferenças significativas que sugiram que o tempo de colheita afeta o perfil lipídico, mas há alguma indicação de que a fonte de carbono tem um efeito e que ocorre mais insaturação se o crescimento ocorrer em temperaturas mais baixas.

Uma vez que uma cultura de células cresceu, os lipídios precisam ser extraídos, separados e purificados. Isso foi alcançado, para PC hidrogenado e deuterado, Moléculas de PS e PE, usando um processo de duas etapas:uma extração em fase sólida seguida de purificação por meio de uma coluna de fase normal acoplada a um sistema de HPLC. Versões hidrogenadas foram preparadas para compará-las com as espécies deuteradas e para testar inicialmente os processos para evitar o desperdício de deutério caro.

Agora, o desafio é purificar espécies moleculares individuais, identificá-los e analisá-los usando uma abordagem de espectrometria de massa. O objetivo final é documentar cuidadosamente todos os procedimentos e protocolos para a produção dessas biomoléculas deuteradas para futuros usuários.