Antes que eles possam sequenciar o DNA ou alterá-lo através da engenharia genética, os cientistas devem primeiro isolá-lo. Isso pode parecer uma tarefa difícil, já que as células contêm uma grande variedade de outros compostos, como proteínas, gorduras, açúcares e pequenas moléculas. Felizmente, os biólogos podem fazer uso das propriedades químicas do DNA para separar o DNA desses contaminantes e prepará-lo para um estudo mais aprofundado. Esse processo é chamado de extração de DNA.
Lise Celular
Existem muitas técnicas diferentes empregadas para a extração de DNA. O usado por um laboratório individual depende do tipo de experimento a ser realizado e quão puro o DNA precisa ser. Os cientistas geralmente começam com uma amostra contendo células - uma amostra de tecido ou sangue, por exemplo - e as abrem, ou lisam. Há várias maneiras de lisar células. Adicionar um detergente fará com que eles se separem, assim como os sujeitará a ondas sonoras de alta frequência. Alternativamente, misturar a amostra com esferas de vidro e vibrá-la rapidamente separará fisicamente as células e liberará seu conteúdo.
Aproximações rápidas e sujas
Se não for necessária alta pureza, os cientistas podem adicionar uma amostra. enzima chamada proteinase K para quebrar a maioria das proteínas na amostra, em seguida, usá-lo como é. No entanto, esta técnica é muito suja, uma vez que a maioria dos contaminantes ainda está presente, por isso só é adequado se a velocidade é uma prioridade e a pureza não é problema. Outra abordagem rápida e suja é remover as proteínas aumentando a concentração de sal adicionando sais como acetato de amônio ou potássio para forçar as proteínas a se precipitarem. Esta técnica também é bastante suja, uma vez que muitos outros contaminantes ainda estão presentes.
Extração com Fenol-Clorofórmio
Outra abordagem é lisar as células com detergente e misturar a solução com álcool isoamílico, clorofórmio e fenol. . A solução então se separa em duas camadas. As proteínas acabam na camada orgânica superior, enquanto o DNA permanece na camada aquosa inferior. Esta técnica requer um controle cuidadoso da concentração de sal e pH para bons resultados. É demorado e tanto o fenol como o clorofórmio são produtos químicos altamente tóxicos. Conseqüentemente, enquanto as extrações com fenol-clorofórmio eram uma vez rotineiras, outras técnicas se tornaram mais populares nos últimos anos.
Cromatografia de troca aniônica
A cromatografia de troca aniônica oferece maior pureza e resultados mais consistentes do que o fenol extração com clorofórmio. Um tubo ou coluna é embalado com pequenas partículas que possuem locais carregados positivamente onde uma molécula carregada negativamente ou ânion pode se ligar. O DNA se liga a esses locais de troca aniônica, enquanto outros contaminantes, como proteínas e RNA, são removidos da coluna. Mais tarde, uma solução rica em sal é usada para retirar o DNA da coluna.
Kits
A técnica mais rápida e talvez mais confiável para purificar o DNA é o uso de um kit especialmente fabricado. Esses kits contêm membranas de sílica gel em um tubo. O DNA adere à membrana enquanto outros contaminantes são lavados usando uma série de soluções salinas especialmente preparadas que acompanham o kit. Finalmente, o DNA é lavado da coluna com uma solução de baixo teor de sal. Esses kits são rápidos, fáceis de usar e oferecem resultados reprodutíveis.
Absorbância
Uma vez que o DNA tenha sido isolado e ressuspenso em uma solução tampão de pH controlada, o último passo é testar sua pureza. . Uma maneira fácil e conveniente de fazer isso é verificando a quantidade de luz ultravioleta que ela absorve nos comprimentos de onda de 260 e 280 nanômetros. A absorção a 260 nanômetros dividida por absorção a 280 nanômetros deve ser igual a 1,8 se o DNA for puro. A medição da absorbância a 260 nanômetros também permite determinar a concentração do DNA.
