Os biólogos celulares tradicionalmente usam corantes fluorescentes para marcar e visualizar as células e as moléculas dentro delas sob um microscópio. Com diferentes métodos de microscopia de super-resolução, eles podem até iluminar moléculas individuais e suas complexas interações entre si. Contudo, o hardware de microscopia que lhes permite fazer isso é altamente especializado e caro e, portanto, relativamente raro em laboratórios de todo o mundo, e a operação de tais microscópios é assustadora, pois requer habilidades únicas.

Ralf Jungmann, Ph.D., um ex-aluno do Wyss Institute for Biologicamente Inspired Engineering de Harvard e atualmente professor da Ludwig Maximilian University (LMU) e do Max Planck Institute (MPI) de Bioquímica na Alemanha e do membro do corpo docente do Wyss Institute Peng Yin, Ph.D., têm desenvolvido DNA-PAINT, uma poderosa tecnologia de imagem molecular que envolve interações transientes de DNA-DNA para localizar com precisão os corantes fluorescentes com super-resolução. Contudo, embora os pesquisadores tenham demonstrado o potencial do DNA-PAINT visualizando biomoléculas únicas, como proteínas, em células fixas a uma distância fixa e próxima, a tecnologia ainda não poderia ser aplicada para investigar moléculas nas profundezas das células.

Agora, As equipes de Jungmann e Yin relatam em conjunto uma solução para superar essa limitação. Em seu novo estudo, eles adaptaram a tecnologia DNA-PAINT a microscópios que são difundidos entre os laboratórios de biologia celular, chamados microscópios confocais, e que são usados ​​por pesquisadores para obter imagens de células inteiras e tecidos mais espessos em resolução mais baixa. A equipe do MPI / Wyss Institute demonstra que o método pode visualizar uma variedade de moléculas diferentes, incluindo combinações de diferentes proteínas, RNAs e DNA em toda a profundidade de células inteiras em super-resolução. Publicado em Nature Communications , a abordagem pode abrir a porta para estudos detalhados de localização de uma única molécula em muitas áreas da pesquisa celular.

A abordagem DNA-PAINT anexa uma "fita de âncora de DNA à molécula de interesse. Em seguida, uma" fita de imagem "de DNA marcada com uma sequência complementar se liga transitoriamente à âncora e produz um sinal fluorescente, que ocorre como um evento de piscar definido em sítios moleculares individuais. Como "piscar" é precisamente ajustável, moléculas que estão apenas nanômetros de distância umas das outras podem ser distinguidas - na extremidade de resolução superior da super resolução.

"Nossa nova abordagem, SDC-PAINT, integra os recursos versáteis de super-resolução do DNA-PAINT com os recursos de corte óptico dos microscópios confocais. Assim, criamos os meios para explorar toda a profundidade de uma célula, e para visualizar as moléculas dentro dele em escala nanométrica, "disse Jungmann. A equipe mapeou a presença de diferentes combinações de proteínas dentro de células inteiras e foi além disso." Ao diversificar nossas abordagens de rotulagem, também visualizamos diferentes tipos de biomoléculas individuais no núcleo que contém o cromossomo, incluindo sequências no DNA, proteínas ligadas ao DNA ou à membrana que envolve o núcleo, bem como RNAs nucleares, "adiciona Yin, que também é co-líder da Iniciativa de Robótica Molecular do Wyss Institute, e professor de Biologia de Sistemas na Harvard Medical School. .

Em princípio, microscópios confocais usam os chamados furos de alfinetes para eliminar a fluorescência fora de foco indesejada dos planos de imagem acima e abaixo do plano focal. Ao escanear a amostra, avião após avião, os pesquisadores podem reunir os sinais de fluorescência emitidos por corantes ligados às moléculas em toda a profundidade. Especificamente, a equipe do MPI / Wyss Institute desenvolveu a técnica para microscópios "Spinning Disk Confocal" (SDC) que detectam sinais de fluorescência de um plano inteiro de uma só vez, detectando-os através de um disco giratório com múltiplos orifícios. Além disso, "para alcançar super-resolução 3D, colocamos uma lente adicional no caminho de detecção, que nos permite arquivar resolução limitada por sub-difração na terceira dimensão "disse o primeiro autor Florian Schueder, um estudante de graduação que trabalha com Jungmann que também trabalhou com a equipe do Wyss Institute de Yin como parte de sua tese de mestrado.

"Esta adição pode ser facilmente customizada pelos fabricantes de microscópios SDC; portanto, basicamente implementamos microscopia de super-resolução sem alterações complexas de hardware para microscópios que geralmente estão disponíveis para biólogos celulares de todos os locais de pesquisa biomédica. A abordagem, portanto, tem o potencial de democratizar super - imagem de resolução em células e tecidos inteiros, "disse Jungmann.

“Com este importante avanço, microscopia de super-resolução e DNA-PAINT podem se tornar mais acessíveis para pesquisadores biomédicos, acelerando nossos insights sobre a função de moléculas individuais e os processos que controlam dentro das células, "disse o Diretor Fundador do Wyss Institute, Donald Ingber, M.D., Ph.D., que também é o professor Judah Folkman de Biologia Vascular no HMS e do Programa de Biologia Vascular no Hospital Infantil de Boston, bem como Professor de Bioengenharia no SEAS.