As membranas celulares consistem em fosfolipídios e proteínas ligadas ou incorporadas. As proteínas da membrana desempenham papéis vitais no metabolismo e na vida da célula. Você não pode usar a microscopia comum para visualizar ou caracterizar proteínas de adesão, transportar proteínas e canais de proteínas na membrana celular. O uso da microscopia eletrônica e uma técnica chamada "fratura por congelamento", que separa as membranas celulares congeladas, permite a visualização da estrutura da membrana e a organização das proteínas no mar dos fosfolipídios. A combinação de outros métodos com a fratura por congelamento não apenas nos ajuda a entender a estrutura de diferentes membranas celulares e proteínas da membrana, mas também permite a visualização e análise detalhada da função de proteínas, bactérias e vírus específicos.
Etapas básicas da fratura por congelamento < Usando nitrogênio líquido, amostras ou células de tecido biológico são rapidamente congeladas para imobilizar os constituintes celulares. As membranas celulares são compostas por duas camadas de fosfolipídios, chamadas de bicamada, onde as caudas lipídicas hidrofóbicas ou que odeiam a água apontam para o interior da membrana e as extremidades hidrofílicas ou que amam a água da molécula apontam para fora e em direção à o interior da célula. A amostra congelada é rachada ou fraturada com um micrótomo, que é um instrumento semelhante a uma faca para cortar fatias finas de tecido. Isso faz com que a membrana celular se separe precisamente entre as duas camadas, porque a atração entre as caudas lipídicas hidrofóbicas representa o ponto mais fraco. Após a fratura, a amostra é submetida a um procedimento a vácuo, chamado "gravação por congelamento". A superfície da amostra fraturada é sombreada com vapor de carbono e platina para criar uma réplica estável, que segue os contornos do plano de fratura. O ácido é usado para digerir o material orgânico aderente à réplica, deixando uma fina camada de platina da superfície da membrana fraturada. Esse invólucro é então analisado por microscopia eletrônica.
Gravação por congelamento
Gravação por congelamento é a secagem a vácuo de uma amostra biológica não fixada, congelada e com fratura por congelamento. O procedimento de secagem a vácuo é semelhante ao liofilização de frutas e legumes embalados e vendidos em supermercados. Sem a gravação por congelamento, muitos detalhes da estrutura celular são obscurecidos por cristais de gelo. A etapa de gravação profunda ou por congelamento melhora e estende o método original de fratura por congelamento, permitindo a observação das membranas celulares durante várias atividades. Ele permite a análise não apenas da estrutura da membrana, mas também dos componentes intracelulares e fornece informações estruturais detalhadas sobre bactérias, vírus e grandes complexos de proteínas celulares.
Microscopia Eletrônica
A microscopia eletrônica pode revelar e ampliar mais mais de um milhão de vezes os menores organismos ou estruturas, como bactérias, vírus, componentes intracelulares e até proteínas. A visualização é criada bombardeando uma amostra ultrafina com um feixe de elétrons. Os dois métodos de microscopia eletrônica são a microscopia eletrônica de varredura, ou SEM, e a microscopia eletrônica de transmissão, ou TEM. Amostras de fraturas por congelamento são analisadas rotineiramente com TEM. O TEM tem uma resolução melhor que o SEM e oferece informações estruturais de até 3 nanômetros de réplicas.
Revealing Cell Membrane Structure
O desenvolvimento e o uso da microscopia eletrônica de fratura por congelamento mostraram que as membranas plasmáticas das células são compostas de bicamadas lipídicas e esclareceu como as proteínas são organizadas nas membranas celulares. A fratura por congelamento fornece uma visão única do interior das membranas celulares, porque divide e separa os fosfolipídios da membrana em duas folhas ou faces opostas e complementares. Nos mais de 50 anos desde a introdução da primeira máquina de fratura por congelamento, fazer uma réplica de platina ainda é a única maneira de obter informações estruturais sobre a membrana celular. A técnica mostra se proteínas específicas flutuam ou estão ancoradas na membrana celular e se e como algumas proteínas se agregam. Um método mais recente - o uso de anticorpos direcionados a proteínas específicas - é combinado com a fratura por congelamento para identificar proteínas e sua função na membrana celular.
