p As linhas celulares injetadas com ácido nucleico livre são amplamente utilizadas para a descoberta de medicamentos e modelagem de doenças. Para evitar populações de células geneticamente misturadas, os investigadores usam técnicas de diluição para selecionar células únicas que irão gerar linhas idênticas. Contudo, a rota de limitar as diluições é tediosa e demorada. p Um novo estudo realizado por pesquisadores da Northwestern mostra como Nanofountain Probe Electroporation (NFP-E), uma ferramenta que entrega moléculas em células individuais, poderia resolver esse problema, e pode levar a novas aplicações para triagem de drogas e elaboração de cursos de tratamento específicos para cada paciente.

p O time, liderado por Horacio Espinosa da Northwestern Engineering e incluindo Joshua Leonard, demonstra a versatilidade do NFP-E - que introduz DNA ou RNA nas células usando eletricidade. Ele também pode fornecer proteínas e plasmídeos em uma variedade de tipos de células animais e humanas com controle de dosagem. A equipe incluiu John Kessler, o professor Ken e Ruth Davee de Biologia de Células-Tronco e professor de neurologia e farmacologia na Escola de Medicina Feinberg da Universidade Northwestern.

p O novo método pode ser usado para estudar doenças ou para terapia celular. Na antiga, o genoma é manipulado. No ultimo, a edição de genes ocorre em células como as células T para tratar o câncer com imunoterapias.

p Ao empregar eletroporação de célula única, o processo de introdução de DNA ou RNA em células individuais usando um pulso de eletricidade, que abrem brevemente os poros da membrana celular, seu trabalho mostra como NFP-E consegue controle fino sobre a expressão relativa de dois plasmídeos co-transfectados. Além disso, ao emparelhar eletroporação de célula única com imagem fluorescente de lapso de tempo, sua investigação revela tempos característicos para o fechamento de eletroporos.

p "Demonstramos o potencial da tecnologia NFP-E na manipulação de uma variedade de tipos de células com controle estequiométrico de carga molecular que pode ser usada para a realização de uma ampla gama de estudos em triagem de drogas, terapias celulares, e biologia sintética, "disse Espinosa, James N. e Nancy J. Farley Professor em Fabricação e Empreendedorismo e professor de engenharia mecânica e (por cortesia) engenharia biomédica e engenharia civil e ambiental.

p Atualmente, as biomoléculas podem ser entregues nas células de várias maneiras:vetores virais; transportadores químicos, tais como péptidos de penetração celular e nanocápsulas de polímero; lipofectamina, e eletroporação em massa.

p "Existem várias estratégias para a entrega de biomoléculas nas células, mas cada um tem suas limitações, "disse Leonard, professor associado de engenharia química e biológica e Charles Deering McCormick Professor de Excelência em Ensino. "Por exemplo, os transportadores químicos conferem uma entrega relativamente lenta e podem ser tóxicos para a célula; os vetores virais são freqüentemente eficientes, mas podem induzir respostas imunológicas adversas e genotoxicidade por inserção. O uso de qualquer método tradicional muitas vezes requer um esforço substancial para otimizar o protocolo, dependendo do tipo de célula e molécula a ser entregue, e, Portanto, uma estratégia de entrega de biomolécula prontamente generalizável ofereceria algumas vantagens significativas. "

p O novo sistema NFP-E permite a entrega de DNA em uma única célula, RNA, e proteínas em diferentes linhas de células imortalizadas, bem como células primárias com mais de 95 por cento de eficiência e mais de 90 por cento de viabilidade celular.

p "Os resultados indicam que o tempo de resselagem da membrana celular varia não linearmente com a tensão de pulso e o número de pulsos de eletroporação, atingindo um máximo em valores intermediários, "Disse Espinosa." Isso significa que longos tempos de pulsação ou altas voltagens parecem não ser necessários para o transporte molecular eficiente através das membranas celulares. Esse recurso é importante na obtenção de alta eficiência de transporte, mantendo a toxicidade celular ao mínimo. "

p Usando tecnologia de eletroporação de célula única, os pesquisadores foram capazes de compreender os mecanismos de transporte envolvidos na amostragem de células baseadas em eletroporação localizada. Um obstáculo para a amostragem de uma única célula temporal não destrutiva são as pequenas quantidades de citosol - o fluido dentro das células - que são extraídas, o que torna um desafio testar ou detectar sequências de RNA ou proteínas.

p A pesquisa mostrou que a escala do tempo de resselagem da membrana é uma função de vários parâmetros de eletroporação, fornecendo uma visão sobre a dinâmica de eletroporos pós-pulso.

p "O trabalho aborda a necessidade de compreender maneiras de aumentar a quantidade de amostra de citosol, sem afetar adversamente as células, "Disse Espinosa." Isso pode guiar a comunidade de pesquisa no planejamento de experimentos voltados para a amostragem baseada em eletroporação de moléculas intracelulares para análise de células temporais. "

p Esta pesquisa está relacionada a trabalhos anteriores que desenvolveram um método minimamente invasivo para amostrar células que podem ser repetidas várias vezes. Essa investigação anterior, que usava pulsos elétricos para extrair enzimas do citosol, compreensão auxiliada da cinética de formação e fechamento de poros.

p O papel, "Nanofountain Probe Electroporation Habilita Versatile Single-Cell Intracelular Delivery and Investigation of Postpulse Electropore Dynamics" foi publicado em 2 de outubro no jornal Pequena .