p Os diagnósticos de célula única emergentes contam com o potencial de isolar bactérias de matrizes biológicas complexas de maneira rápida e eficiente. Em um estudo recente agora publicado em Microsistemas e Nanoengenharia , Jung Y. Han e colegas dos Departamentos interdisciplinares de Engenharia Mecânica, A Engenharia Química Biomolecular e a Bioengenharia nos EUA desenvolveram um dispositivo para isolar bactérias intactas e viáveis ​​do sangue total usando um microfluídico, monólito de sílica porosa. Eles alcançaram hemólise mecânica ao mesmo tempo que proporcionavam a passagem de bactérias intactas e viáveis ​​pelos monólitos para isolamento bacteriano baseado em tamanho e lise seletiva. Han et al. descreveu um processo para sintetizar grandes quantidades de elementos de monólito ligados a capilares discretos e tijolos de monólito em escala milimétrica para integrar em chips microfluídicos. p Eles exploraram o impacto da morfologia monolítica, geometria e condições de fluxo na lise celular e regimes de fluxo que permitiram a lise celular seletiva e a passagem seletiva de várias bactérias gram negativas e gram positivas. A técnica empregada por Han et al. permitiu a preparação rápida da amostra e análise bacteriana quando combinada com espectrometria Raman de célula única. O trabalho fornece etapas exclusivas de preparação de amostras para dar suporte à análise bacteriana rápida e sem cultura para aplicações em dispositivos biomédicos de ponto de atendimento.

p Bactérias no sangue podem levar à sepse, infecção de tecidos e outras condições médicas graves, requer a identificação precoce de bactérias transmitidas pelo sangue para um tratamento eficaz. A capacidade de identificar bactérias rapidamente usando diagnósticos point-of-care pode aumentar muito o potencial clínico para o tratamento ideal durante o estágio inicial de infecção. O padrão ouro existente para caracterização bacteriana é baseado na análise de cultura de células fenotípicas e requer pelo menos 24 horas para coletar amostras para cultura e análise em um laboratório de microbiologia clínica e diagnóstica. A técnica existente é robusta e barata, mas não pode gerar resultados oportunos para orientar os estágios iniciais do tratamento.

p No presente trabalho, Han et al. explorou dispositivos microfluídicos integrados com monólitos de sílica porosa como elementos de fluxo simples para análise seletiva de células sanguíneas e o isolamento intacto de bactérias. Monólitos são materiais altamente porosos compostos de morfologia de células abertas com caminhos tortuosos de fluxo de fluido. Os cientistas podem controlar a morfologia monolítica dos poros por meio de alto estresse mecânico de superfície durante a perfusão celular para hemólise mecânica das células sanguíneas, enquanto permite que bactérias intactas e viáveis ​​viajem pelos caminhos sinuosos do fluxo para seu isolamento sem cultura. Han et al. usaram a abordagem de passagem seletiva para bactérias em sangue total sob condições de fluxo para espécies gram-positivas e gram-negativas, apesar das diferenças das cepas bacterianas. A técnica de lise de monólito seletivo de alto rendimento combinada com métodos analíticos poderosos, como a espectroscopia Raman, pode permitir a análise sem cultura de bactérias no sangue total no nível de uma única célula.

p Han et al. processos de síntese de monólito de sílica modificados anteriormente relatados, seguido por hidrólise e condensação de sílica para formar vidro de sílica em baixas temperaturas. Para preparar o monólito de sílica, os cientistas usaram uma solução precursora composta de alquil silicatos, polietilenoglicol (PEG) como um porogênio, ureia como fonte de íons hidroxila para minimizar a heterogeneidade e ácido acético. Quando eles otimizaram o processo sintético, os monólitos resultantes eram homogêneos e bem ancorados às paredes capilares de sílica. Os cientistas mediram a espessura da estrutura final do monólito esquelético e calcularam sua permeabilidade usando cromatografia líquida de alto desempenho para controlar as condições experimentais. Para minimizar a variação intrínseca, Han et al. corte os tubos capilares resultantes em segmentos de 5 cm de comprimento para testar a permeabilidade antes do uso.

p Eles então desenvolveram dois métodos complementares para operação de baixo e alto rendimento para integrar monólitos de sílica em sistemas microfluídicos. Para permitir a operação de baixo rendimento, os cientistas incorporaram segmentos capilares contendo monólito em chips microfluídicos termoplásticos para proteger o monólito durante a integração. Para lise seletiva de alto rendimento, eles usaram monólitos com áreas de seção transversal maiores dentro dos dispositivos microfluídicos. O método completo de fabricação rendeu excelente confiabilidade para operação sem vazamentos durante a perfusão de sangue total.

p Como prova de princípio, Han et al. selecionado Enterobacter cloacae (gram-negativo, bactérias em forma de bastonete) para explorar sua eficácia de passagem, ao lado de três bactérias gram-positivas; Lactococcus lactis, Micrococcus luteus e Bacillus subtilis. Durante os experimentos, eles perfundiram soluções bacterianas através dos monólitos microfluídicos com geometria e condições de fluxo variadas para testar a passagem de bactérias e a lise das células sanguíneas usando espalhamento dinâmico de luz (DLS). Por exemplo, a perfusão de E. cloacae purificada através do monólito não produziu mudanças discerníveis nos picos DLS, indicando a passagem intacta de bactérias.

p Os cientistas mostraram o efeito do comprimento do dispositivo de monólito poroso na eficiência da lise dos glóbulos vermelhos (RBC). Os resultados indicaram que a eficiência de lise de RBC aumentou significativamente para comprimentos de monólito acima de 1 mm. Han et al. também estudou o destino dos glóbulos brancos (leucócitos) durante a operação do dispositivo monólito, as células não podiam passar pelo monólito sem serem lisadas de maneira semelhante aos eritrócitos. Tecnicamente, RBCs deformados em uma forma discóide para passar pelo monólito, o que causou um aumento significativo da tensão da membrana, resultando em lise de hemácias. Comparativamente, as células bacterianas tinham dimensões semelhantes aos poros do monólito e, portanto, exigiam menos expansão da parede celular para uma passagem bem-sucedida sem ruptura. Os cientistas otimizaram os parâmetros do dispositivo para diversas bactérias para tolerar altos níveis de estresse de membrana sem ruptura. Desenvolvimentos posteriores garantiram a passagem intacta das bactérias, sem degradação e com viabilidade.

p Para passagem de bactérias de alto rendimento, os cientistas diluíram o sangue nos dispositivos capilares. Contudo, como uma alternativa, eles também podem estender a capacidade dos monólitos para a lise do sangue total. Os dispositivos processaram mais de 400 µL de sangue total enriquecido com bactérias antes de exibir um aumento significativo na contrapressão, devido ao entupimento como resultado da lise celular e também devido a leucócitos intactos (leucócitos) presos na matriz porosa.

p Para localizar bactérias alvo, Han et al. obteve uma amostra depositada em uma lâmina de vidro, depois de passar pelo processo de monólito. Eles conduziram a análise Raman de uma única célula digitalizando manualmente a sonda óptica em toda a amostra. Eles esperam o uso de tecnologia de lise seletiva, acoplado à microscopia Raman confocal no futuro para melhorar o processo de detecção de cepas bacterianas de interesse em baixas concentrações em um local de interesse definido.

p Desta maneira, Jung Y. Han e seus colegas desenvolveram um monólito microfluídico para isolar com eficiência bactérias intactas com teranóstica ampla, potencial de ponto de atendimento para aplicações clínicas. Eles imaginam a união de ferramentas de microscopia Raman confocal que atualmente estão em grande parte confinadas ao laboratório de pesquisa com sistemas miniaturizados e portáteis emergentes para preparar o caminho para dispositivos de atendimento rápido e portáteis. p © 2019 Science X Network