p As mitocôndrias são dinâmicas, organelas intracelulares bioenergéticas, responsável pela produção de energia através da produção de ATP durante a respiração. Eles estão envolvidos nas principais tarefas metabólicas celulares que regulam as respostas fisiológicas vitais das células, incluindo sinalização celular, diferenciação celular e morte celular. Mitocôndrias defeituosas estão ligadas a várias doenças genéticas humanas críticas, incluindo doenças neurodegenerativas, câncer e doenças cardiovasculares. p A caracterização detalhada das mitocôndrias funcionais permanece relativamente inexplorada devido à falta de métodos eficazes de extração de organelas. Por exemplo, o processo de extração deve sustentar funcionalidade suficiente da organela ex vivo para iluminar suas funções citosólicas na presença de citoesqueleto e outras organelas subcelulares. Uma vez que as mitocôndrias crescem em uma rede reticular complexa dentro das células para sofrer alternâncias estruturais, sua caracterização intracelular é ainda mais complicada. Como resultado, a análise in vitro de mitocôndrias continua sendo o método principal, para extrair e compreender separadamente as propriedades intrínsecas das mitocôndrias, sem a interferência de outras organelas subcelulares.

p Em um estudo recente, agora publicado em Microsistemas e Nanoengenharia , Habibur Rahman e colegas do Departamento de Engenharia Biomédica exploraram a possibilidade de controlar o estresse hidrodinâmico para uma extração mitocondrial eficiente. Por esta, eles usaram geometria microfluídica de junção cruzada em microescala para romper seletivamente a membrana celular, garantindo a integridade da membrana mitocondrial.

p Os avanços na microfluídica demonstraram as vantagens dos procedimentos laboratoriais on-chip com tamanho de amostra significativamente reduzido e reprodutibilidade experimental aumentada. O estresse hidrodinâmico produzido em chips microfluídicos pode ser usado para abrir membranas celulares ou nucleares transitoriamente durante a entrega de genes intracelulares. O potencial de tais técnicas raramente foi examinado para a extração de organelas subcelulares, uma vez que as geometrias restritas dos microcanais podem causar o entupimento do componente subcelular nas micromáquinas.

p Os autores otimizaram as condições experimentais de operação com base em estudos anteriores para efetivamente destruir as membranas celulares, mantendo mitocôndrias intactas em modelos de linhagens de células de mamíferos. As linhas celulares modelo de interesse eram células renais embrionárias humanas (HEK293), células musculares de camundongo (C2C12) e células de neuroblastoma (SH-SY5Y).

p No princípio de funcionamento do triturador de células em microescala proposto, os cientistas mediram a diferença no módulo de elasticidade entre a membrana mitocondrial e a membrana celular para romper a célula enquanto retém a membrana mitocondrial. Um aumento do nível de estresse no sistema pode romper as membranas celulares com módulos elásticos mais elevados (como visto com a linha celular de neuroblastoma). O estudo comparou o rendimento de proteína e a concentração de mitocôndrias funcionais extraídas usando o método proposto vs. kits disponíveis comercialmente para uma gama de concentrações de células.

p As descobertas mostraram que o método proposto de trituração de células em microescala foi mais eficiente do que os kits comerciais, produzindo aproximadamente 40 por cento mais mitocôndrias funcionais. Os cientistas conseguiram preservar a integridade estrutural das organelas extraídas, mesmo em baixas concentrações de células. O método pode processar rapidamente uma quantidade limitada de amostras (200 µl).

p Os resultados detalhados foram a primeira demonstração em estudo de extração de mitocôndrias intactas e funcionais usando estresse hidrodinâmico em microescala. A possibilidade de processamento em baixa concentração e pequeno tamanho de amostra é favorável para investigações clínicas de doenças mitocondriais. Para testar a tensão exercida pela junção cruzada projetada, eles usaram um modelo de simulação COMSOL Multiphysics primeiro. Depois disso, Rahman et al. determinou experimentalmente a taxa de fluxo volumétrico para três linhas de células modelo. Durante a ruptura da membrana celular experimental, sob tensão de cisalhamento média (16,4 Pa, para uma taxa de fluxo de 60 µL / min), organelas subcelulares foram liberadas e detectadas com sinais positivos mitocondriais aumentados.

p Os cientistas compararam a capacidade do triturador de células miniaturizado com a de dois kits comerciais:o homogeneizador Dounce (método mecânico de ruptura celular) e o kit de isolamento de mitocôndrias Qproteome (método químico de ruptura celular) para extrair mitocôndrias. Para determinar o número de mitocôndrias funcionais extraídas, os cientistas usaram MitoTracker - um corante fluorescente que mancha as mitocôndrias durante a análise de citometria de fluxo. Os resultados mostraram que o triturador de células em microescala foi capaz de extrair 40% mais mitocôndrias funcionais em comparação com os kits comerciais para células HEK 293 e C2C12.

p Rahman et al. conduziram o ensaio da citrato sintase para determinar a integridade mitocondrial por meio da atividade enzimática de mitocôndrias danificadas. Como antes, em comparação com os kits comerciais, integridade mitocondrial foi maior para aqueles extraídos usando o triturador em microescala em células HEK293 e C2C12.

p O estudo demonstrou a importância da rigidez da membrana ao validar o conceito proposto para romper as membranas celulares do neuroblastoma (SH-SY5Y). Uma vez que a membrana celular SH-SY5Y tinha um módulo de elasticidade mais alto do que as linhas celulares HEK293 e C2C12, os cientistas tiveram que otimizar a taxa de fluxo volumétrico no triturador em microescala para romper efetivamente as membranas celulares SH-SY5Y. Novamente, em comparação com as extrações de kits comerciais, usando o método proposto entregou uma concentração significativamente maior de proteína e mitocôndrias funcionais para a linha celular de interesse.

p Desta maneira, Rahman et al. investigou a possibilidade de romper a membrana celular para reter a integridade das membranas mitocondriais em diversas linhas de células modelo de mamíferos. Eles determinaram a tensão extensional ideal e a taxa de fluxo dentro de um biorreator de seção transversal microfluídica, com base no módulo de Young da linha celular modelo de interesse. Durante o design do canal, os cientistas incluíram uma seção de estreitamento no biorreator microfluídico fabricado com litografia suave.

p O triturador de células em microescala de microfluídica proposto demonstrou capacidade superior para extrair mitocôndrias e proteínas funcionais, controlando o estresse hidrodinâmico pela primeira vez, em comparação com kits de extração de organelas celulares disponíveis no mercado. Os experimentos foram viáveis ​​mesmo com quantidades mínimas de amostras (volume de 200 µl, contendo 10 ⁴ células / mL) para potenciais aplicações clínicas. Rahman et al. foram capazes de replicar fielmente o protocolo em três linhas de células. O trabalho experimental pode ser traduzido para um ambiente clínico para entender os distúrbios relacionados à disfunção mitocondrial em profundidade. p © 2019 Science X Network