Os microscópios convencionais fornecem informações essenciais sobre as amostras em duas dimensões - o plano da lâmina do microscópio. Mas plano não é tudo isso. Em muitos casos, informações sobre o objeto na terceira dimensão - o eixo perpendicular à lâmina do microscópio - são igualmente importantes para medir.

Por exemplo, para entender a função de uma amostra biológica, seja uma fita de DNA, tecido, órgão ou organismo microscópico, os pesquisadores gostariam de ter o máximo de informações possível sobre a estrutura tridimensional e o movimento do objeto. As medições bidimensionais geram uma compreensão incompleta e às vezes insatisfatória da amostra.

Agora, pesquisadores do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) encontraram uma maneira de converter um problema que afeta quase todos os microscópios ópticos - aberrações de lentes, que causam focalização imperfeita da luz - em uma solução que permite aos microscópios convencionais medir com precisão as posições dos pontos de luz em uma amostra em todas as três dimensões.

Embora outros métodos tenham permitido aos microscópios fornecer informações detalhadas sobre a estrutura tridimensional, essas estratégias tendem a ser caras ou requerem conhecimento especializado. Em uma abordagem anterior para medir posições na terceira dimensão, pesquisadores alteraram a ótica dos microscópios, por exemplo, adicionando astigmatismo extra às lentes. Essas alterações frequentemente exigiam reengenharia e recalibração do microscópio óptico depois que ele saía da fábrica.

O novo método de medição também permite que os microscópios localizem com mais precisão e precisão as posições dos objetos. Os microscópios ópticos normalmente resolvem as posições dos objetos em uma região não menor do que algumas centenas de nanômetros (bilionésimos de um metro), um limite estabelecido pelo comprimento de onda da luz que forma a imagem e o poder de resolução das lentes do microscópio. Com a nova técnica, microscópios convencionais podem localizar as posições de partículas emissoras de luz individuais dentro de uma região um centésimo tão pequena.

Pesquisadores do NIST Samuel Stavis, Craig Copeland e seus colegas descreveram seu trabalho na edição de 24 de junho da Nature Communications .

O método se baseia em uma análise cuidadosa de imagens de partículas fluorescentes que os pesquisadores depositaram em placas de silício planas para calibração de seu microscópio. Devido às aberrações da lente, conforme o microscópio se movia para cima e para baixo em incrementos específicos ao longo do eixo vertical - a terceira dimensão - as imagens pareciam desequilibradas e as formas e posições das partículas pareciam mudar. Os pesquisadores do NIST descobriram que as aberrações podem produzir grandes distorções nas imagens, mesmo se o microscópio se mover apenas alguns micrômetros (milionésimos de metro) no plano lateral ou algumas dezenas de nanômetros na dimensão vertical.

A análise permitiu aos pesquisadores modelar exatamente como as aberrações das lentes alteraram a aparência e a localização aparente das partículas fluorescentes com mudanças na posição vertical. Calibrando cuidadosamente a mudança de aparência e localização aparente de uma partícula em sua posição vertical, a equipe conseguiu usar o microscópio para medir com precisão as posições em todas as três dimensões.

"Contra-intuitivamente, as aberrações da lente limitam a precisão em duas dimensões e permitem a precisão em três dimensões, "disse Stavis." Desta forma, nosso estudo muda a perspectiva da dimensionalidade das imagens do microscópio óptico, e revela o potencial de microscópios comuns para fazer medições extraordinárias. "

Usar a informação latente fornecida pelas aberrações de lente complementa os métodos menos acessíveis que os microscopistas atualmente empregam para fazer medições na terceira dimensão, Stavis notou. O novo método tem o potencial de ampliar a disponibilidade de tais medições.

Os cientistas testaram seu método de calibração usando o microscópio para criar imagens de uma constelação de partículas fluorescentes depositadas aleatoriamente em uma engrenagem microscópica de silício que girava em todas as três dimensões. Os pesquisadores mostraram que seu modelo corrigido com precisão para as aberrações da lente, permitindo que o microscópio forneça informações tridimensionais completas sobre a posição das partículas.

Os pesquisadores foram então capazes de estender suas medições de posição para capturar toda a amplitude de movimento da engrenagem, incluindo sua rotação, balançando e balançando, completando a extração de informações espaciais do sistema. Essas novas medições destacaram as consequências das lacunas em nanoescala entre as partes do microssistema, que variou devido a imperfeições na fabricação do sistema. Assim como um rolamento solto em uma roda faz com que ela oscile, o estudo mostrou que as lacunas em nanoescala entre as peças não só degradaram a precisão da rotação intencional, mas também causou oscilação não intencional, balançar e até mesmo flexionar a engrenagem, tudo isso pode limitar seu desempenho e confiabilidade.

Os laboratórios de microscopia podem facilmente implementar o novo método, Copeland disse. "O usuário só precisa de uma amostra padrão para medir seus efeitos e uma calibração para usar os dados resultantes, "adicionou Stavis. Além das partículas fluorescentes ou um padrão semelhante, que já existem ou estão surgindo, nenhum equipamento extra é necessário. O novo artigo de jornal inclui um software de demonstração que orienta os pesquisadores sobre como aplicar a calibração.