Um grupo de pesquisa liderado pelo Professor MATOBA Osamu (Organização para Pesquisa Avançada e Integrada) da Universidade de Kobe criou com sucesso imagens de fluorescência e fase de células vivas em 3D com base em holografia digital. Eles usaram células vegetais com marcadores de proteína fluorescentes em seus núcleos para demonstrar este sistema de imagem.

O grupo consistia no Professor Assistente do Projeto Manoj KUMAR e no Professor Assistente Xiangyu QUAN (ambos da Escola de Pós-Graduação em Informática do Sistema), Professor AWATSUJI Yasuhiro (Instituto de Tecnologia de Kyoto) e Professor Associado TAMADA Yosuke (Universidade de Utsunomiya).

Esta tecnologia formará uma base para imagens de células vivas, o que é indispensável no campo das ciências da vida. Espera-se também que o uso dessa tecnologia para visualizar processos de células-tronco em plantas aumente nosso conhecimento sobre eles.

Os resultados da pesquisa apareceram no jornal Relatórios Científicos , publicado pela Springer Nature em 15 de maio.

Antecedentes de Pesquisa

O microscópio óptico foi inventado no final do século XVI e o cientista britânico Robert Hooke foi o primeiro a descobrir células em meados do século XVII. A invenção foi desenvolvida em novas tecnologias, como o microscópio de contraste de fase (Prêmio Nobel de Física de 1953), que permite que as células vivas sejam observadas sem a necessidade de colorá-las, e imagem celular fluorescente, em que moléculas específicas são marcadas com proteínas fluorescentes (Prêmio Nobel de Química de 2008) e observadas em células vivas. Estas se tornaram ferramentas essenciais para a observação nas ciências da vida e nos campos médicos.

A imagem de fase usa a diferença no comprimento óptico da luz à medida que ela passa por uma amostra biológica para revelar informações estruturais sobre ela. A imagem de fluorescência fornece informações sobre moléculas específicas dentro da amostra biológica, e pode revelar suas funções. Contudo, a estrutura intracelular e a motilidade são complexas. A capacidade de visualizar informações físicas multidimensionais compreendendo imagens de fase e fluorescência seria útil para a compreensão desses aspectos. Um sistema de imagem que pudesse gerar informações físicas variadas simultaneamente e instantaneamente a partir de células vivas 3-D serviria como uma tecnologia de base para trazer inovação em biologia.

O sistema de imagem multimodal híbrido construído neste estudo pode obter informações de fase e fluorescente 3-D em um único disparo. Ele permite que os pesquisadores visualizem quantitativa e simultaneamente as informações estruturais ou funcionais de uma amostra biológica usando uma única plataforma.

Metodologia de Pesquisa

Neste estudo, os pesquisadores construíram um microscópio holográfico digital multimodal que poderia registrar as informações fluorescentes de uma amostra e as informações de fase simultaneamente (Figura 1). Isso usa holografia digital como base, por meio do qual as informações de luz interferida do objeto são registradas e, em seguida, cálculos ópticos feitos por computador são usados ​​para gerar informações espaciais 3-D sobre o objeto.

O microscópio em estudo é composto por dois sistemas ópticos diferentes. Em primeiro lugar, o sistema de imagem de fluorescência holográfica 3-D, como mostrado no lado direito da Figura 1. A fim de obter as informações de fluorescência 3-D, um modulador de luz espacial é usado para dividir a luz fluorescente emitida por moléculas fluorescentes em duas ondas de luz que podem interferir uma na outra.

Neste ponto, a informação 3-D da luz do objeto é preservada dando a uma das ondas de luz um raio de curvatura e direção de propagação ligeiramente diferentes; ao mesmo tempo, as duas ondas de luz estão em uma via ótica compartilhada (principalmente procedendo ao longo do mesmo eixo), permitindo que uma medição de interferência temporariamente estável seja feita. Este sistema óptico foi formulado neste estudo, esclarecer a distribuição de intensidade de interferência registrada pela primeira vez. Essa fórmula permitiu que os pesquisadores encontrassem condições experimentais que melhorassem a qualidade das imagens fluorescentes reconstruídas. Eles foram capazes de gerar imagens tridimensionais de células vivas e suas estruturas aplicando este sistema holográfico 3-D fluorescente. As moléculas e estruturas das células vivas foram marcadas com proteínas fluorescentes, permitindo que seus comportamentos dinâmicos sejam observados através desta nova microscopia de fluorescência 3-D.

A tecnologia de imagem desenvolvida por este estudo permite imagens 3-D, que até agora levavam comparativamente mais tempo para gerar por varredura a laser, para ser gerado em um único tiro, sem a necessidade de digitalização.

Próximo, conforme ilustrado à esquerda da Figura 1, é o sistema de imagem holográfico em 3-D. Uma célula de planta viva é composta de componentes como um núcleo, mitocôndria, cloroplastos, e uma fina parede celular. É possível visualizar as estruturas desses componentes a partir das diferenças de fase (comprimento do caminho óptico). Neste sistema, adotar o interferômetro Mach-Zehnder permite que a onda plana de referência seja usada, permitindo que a franja de interferência ideal para cada objeto medido seja facilmente obtida.

Este microscópio holográfico digital foi criado pela unificação de sistemas de medição de fluorescência e fase.

Subseqüentemente, este microscópio foi utilizado para visualizar células vegetais vivas. Um experimento foi realizado para provar que é possível realizar observações 4-D aplicando 3-D espacial e um eixo de tempo (unidimensional). Foram utilizados o musgo Physcomitrella patens e contas fluorescentes com tamanho médio de 10 μm. As Figuras 2 e 3 mostram os resultados do experimento para fluorescência 3-D simultânea e imagens de fase do musgo. A Figura 2 (b) mostra que sete núcleos são visíveis quando um microscópio de fluorescência de campo completo convencional é usado. Destes sete, os núcleos numerados 1, 2, e 4 estão em foco, Contudo, este não é o caso para os núcleos em locais em diferentes profundidades, pois é uma imagem fluorescente fraca com desfoque generalizado. Na metodologia proposta neste estudo para resolver este problema, a informação da onda de luz fluorescente foi extraída do holograma fluorescente na Figura 2 (c). Com base nessas informações, o algoritmo de propagação de Fresnel numérico pode obter imagens fluorescentes reconstruídas em qualquer profundidade ou distância. Portanto, imagens em foco de vários núcleos fluorescentes em diferentes profundidades foram restauradas a partir de uma única imagem sem varredura.

Figura 2 (d), (e), e (f) mostrar as imagens reconstruídas em três planos diferentes. A distância axial entre (d) e (e) é de 10 micrômetros, e 15 micrômetros entre (e) e (f). As setas amarelas indicam os núcleos que estão em foco. É possível ver quais dos sete núcleos na imagem de fluorescência estão em foco nos três planos.

A Figura 3 mostra a distribuição quantitativa de fases para os três planos em diferentes profundidades. Foi possível visualizar cloroplastos individuais (existem muitos ao redor das bordas das células, conforme indicado pelos picos vermelhos na Figura 3 (b)). A espessura da célula, conforme calculado a partir dos valores de fase quantitativos medidos, era cerca de 17 micrômetros, um tamanho muito próximo de outros valores de referência.

Na Figura 4, você pode ver contas fluorescentes (de cerca de 10 micrômetros de tamanho) flutuando em uma solução. As informações de fase e fluorescência foram geradas a partir de gravações utilizando a metodologia proposta. As contas também se movem na direção da profundidade, portanto, é possível recuperar sua posição 3-D alterando a distância de reconstrução para mantê-los em foco.

Neste estudo, um microscópio holográfico digital multimodal foi desenvolvido, capaz de medições simultâneas de fase 3-D e fluorescência. Com a capacidade de conduzir imagens de fase quantitativa e fluorescência ao mesmo tempo, acredita-se que este método servirá como uma nova tecnologia de base para a visualização de células e tecidos biológicos vivos. Em particular, foi demonstrado que este microscópio pode ser aplicado a células vegetais complexas. Pode ser utilizado para obter uma compreensão diversificada do processo de formação de células-tronco em plantas, que se reproduzem mais facilmente do que as células animais. No futuro, pode ser possível usar essas informações para controlar o processo das células-tronco por meio da estimulação da luz. A reprodução e o crescimento eficientes das plantas, obtidos por meio da imagem proposta e da estimulação futura, podem ser aplicados ao desenvolvimento de um sistema de cultivo de alimentos.

Esta tecnologia pode ser desenvolvida melhorando ainda mais a eficiência do uso da luz. Na holografia digital, é necessário alargar espacialmente o diâmetro do feixe, dividi-lo em dois, e então sobreponha-os novamente para usar a interferência entre os dois caminhos de luz. Portanto, também é necessário aumentar a energia fluorescente para que seja observada pelo sensor de imagem. Para conseguir isso, uma grande quantidade de energia luminosa seria necessária para iluminar as células vivas, Contudo, os danos celulares causados ​​pela luz seriam um grande problema. Pensa-se que um holograma de volume pode ser usado para aumentar a eficiência do uso da luz, evitando a fototoxicidade celular.

Outro problema é que a distribuição 3-D reconstruída se estende na direção de propagação da luz (a direção da profundidade do objeto), diminuição da resolução axial. Os pesquisadores estão trabalhando em métodos que usam aprendizagem profunda e filtragem para suprimir essa extensão na direção de profundidade e melhorar a qualidade da imagem.