O raio-X adequado, protocolo de agente de coloração específico de núcleo para histologia virtual 3D. Protocolo de coloração e interação da coloração de raios-X à base de hemateína com o tecido mole. (A) O procedimento de coloração à base de hemateína desenvolvido mostra as etapas individuais envolvidas, incluindo os tempos de incubação e coloração. A etapa de coloração 1 foi conduzida usando acetato de chumbo (II) tri-hidratado como fonte de metal pesado. O tri-hidrato de acetato de chumbo (II) foi dissolvido em água destilada e é referido como solução de trabalho (A) (WS (A)). A etapa de coloração 2 envolveu uma solução de hemateina em etanol absoluto (WS (B), 10% (p / v); c =333 mM), que foi derivado de hematoxilina e foi adicionado a WS (A). (B) O complexo de chumbo (II) de hematina carregado positivamente (roxo), que é construído in situ na amostra de tecido mole, está interagindo com a estrutura de fosfato carregada negativamente do DNA (laranja) presente no núcleo da célula. A interação seletiva do complexo de chumbo (II) da hematina com o DNA é obtida pela acidificação do tecido mole durante a fixação ou antes da coloração e permite um maior acúmulo do complexo de chumbo (II) da hematina no núcleo da célula. Crédito: Relatórios Científicos , doi:https://doi.org/10.1038/s41598-018-36067-y
A histologia é usada para identificar detalhes estruturais do tecido em microescala no laboratório de patologia, mas as análises permanecem bidimensionais (2D), pois são limitadas ao mesmo plano. As tecnologias 3D não destrutivas, incluindo micro e nano tomografia computadorizada de raios-X (nanoCT), têm validade comprovada para compreender as estruturas anatômicas, uma vez que permitem ângulos de visão arbitrários e detalhes estruturais 3D. Contudo, a baixa atenuação do tecido mole tem dificultado sua aplicação no campo da histologia virtual 3D. Em um estudo recente, agora publicado em Relatórios Científicos , Mark Müller e colegas do Departamento de Física e Bioengenharia desenvolveram um método de coloração de raios-X à base de hemateina para alvejar especificamente os núcleos das células, seguido por demonstrações em um lóbulo de fígado inteiro de um camundongo.
O novo protocolo de coloração combinou o recentemente desenvolvido, sistema nanoCT de alta resolução para visualização 3D da arquitetura do tecido em escala nanométrica. Os resultados revelaram a verdadeira morfologia 3D ao lado da distribuição espacial dos núcleos das células. A técnica também era compatível com a histologia convencional, já que lâminas microscópicas com amostra de tecido mole podem ser coradas com o mesmo protocolo ao lado de contra-coloração adicional. O método demonstrou a possibilidade de futuras aplicações em histopatologia acompanhada de aparelhos de tomografia computadorizada de raios-X em laboratório.
A histologia é o padrão ouro existente para um diagnóstico microanatômico preciso no laboratório de patologia, no entanto, as técnicas e os resultados são limitados a 2D. Por exemplo, uma biópsia 3D é geralmente examinada usando lâminas microscópicas muito finas (contendo cortes de 2 a 10 µm de espessura) por meio de técnicas convencionais e modernas de imuno-histoquímica e técnicas de coloração histológica. Micro e nano CT são ferramentas poderosas que podem fornecer uma reconstrução precisa do tecido em 3D. Os desenvolvimentos na tecnologia permitiram uma resolução comparativamente alta para a histologia convencional 2D existente, usando dispositivos que variam de grandes aceleradores de partículas a dispositivos de raios-X baseados em laboratório.
Juntamente com os requisitos técnicos, Agentes de coloração adequados para raios-X (agentes de contraste), como ácido fototúngstico (PTA), iodeto de potássio de iodo (IKI), iodo em etanol (12E), ou iodo em metanol (12M) também são importantes. Os agentes de coloração disponíveis são, no entanto, atualmente limitado em escopo e eficácia. Ao desenvolver diagnósticos médicos de última geração em histopatologia, os cientistas pretendem otimizar as técnicas e compreender a arquitetura do tecido, desde o nível celular até a escala do tecido.
Cortes de TC do mesmo lóbulo de fígado de camundongo inteiro antes e depois da coloração destacando o aumento de contraste obtido após a aplicação da coloração de raios-X à base de hemateina. Ambos os conjuntos de dados foram adquiridos com o microCT Xradia Versa 500 usando parâmetros de aquisição idênticos. O tamanho do voxel em ambos os conjuntos de dados é 13,5 µm. (UMA, C e E) Imagens de visão geral do lóbulo de fígado de camundongo sem coloração, representando as visualizações ao longo dos eixos cartesianos. (B, D e F) Imagens de visão geral da mesma amostra de lóbulo de fígado de camundongo em (A, C e E) após a coloração representando as vistas ao longo dos eixos cartesianos. Estruturas anatômicas, como a vasculatura, são visualizadas. Crédito: Relatórios Científicos , doi:https://doi.org/10.1038/s41598-018-36067-y.
Durante o primeiro diagnóstico em patologia clínica, os núcleos celulares e o citoplasma são importantes. Quase todas as amostras histológicas são, portanto, frequentemente coradas por meio do protocolo padrão de hematoxilina e eosina (H&E) para identificar os núcleos e citoplasma. Mas os padrões para a coloração de hematoxilina não são fixos e existem muitas variantes do protocolo devido aos diversos tipos de tecido e / ou parâmetros de pré-tratamento envolvidos. Como resultado, Müller et al. introduziu um protocolo de coloração à base de hemateína, desenvolvido especificamente para CT, para permitir a visualização 3D direta dos núcleos das células em amostras de tecidos moles. O poderoso potencial de microCT ou nanoCT combinado com manchas adequadas de raios-X permitirá futuras percepções sobre a organização do tecido para entender doenças, incluindo osteoartrite e câncer, na nanoarquitetura celular.
Ao desenvolver o novo adequado para raios-X, coloração à base de hemateina, a hematoxilina de Mayer comumente usada e a hematoxilina de ferro de Wiegert foram incluídas em sua constituição. Os experimentos de coloração foram realizados no tecido do lóbulo de fígado de camundongo, usado posteriormente para imagens de TC de raios-X. O protocolo de coloração otimizado continha cinco etapas começando com acidificação controlada de amostras de tecidos moles durante a fixação. O tecido mole foi preparado no nível molecular para ser corado com o complexo de chumbo (II) hematina.
Em seu mecanismo de ação, os cientistas mostraram uma interação iônica fortalecida entre o complexo de chumbo (II) de hemateina carregado positivamente e a estrutura de fosfato carregada negativamente do ácido desoxirribonucléico (DNA). A reação química garantiu um maior acúmulo do agente de coloração dentro dos núcleos das células, formando um complexo de DNA de chumbo (II) de hematina, como um agente adequado para raios-X.
Dados NanoCT (A – C) em comparação com a lâmina histológica microscópica (D) derivada do mesmo lóbulo de fígado de camundongo após a aplicação do protocolo de coloração de raios-X baseado em hemateína. A visualização clara dos núcleos das células de hepatócitos maiores e dos núcleos das células menores, como células de Kupffer e SECs em branco (A – C) ou roxo escuro (D) e a rede BC exibida em preto (A-C) ou branco (D) foi alcançada, respectivamente. (A) O volume de interesse (VOI) destacando as duas fatias nanoCT mostradas em (B, moldura azul) e (C, moldura laranja). (B, C) Fatias nanoCT individuais representativas conforme indicado no VOI de (A). (B) e (C) são posicionados ortogonais entre si. A orientação da rede BC, que é formado pelos hepatócitos é visto, isto é, uma disposição mais horizontal é vista em (B) e um alinhamento mais vertical em (C). A espessura da fatia nanoCT é de 580 nm. (D) Lâmina microscópica histológica representativa com uma espessura de 3 µm obtida a partir da mesma amostra de lóbulo de fígado de camundongo após a aplicação da coloração à base de hemateína e sua incorporação em um bloco de parafina. Crédito: Relatórios Científicos , doi:https://doi.org/10.1038/s41598-018-36067-y.
Para comparar a eficácia da coloração, o tecido do lóbulo do fígado de camundongo foi fotografado com microCT antes da coloração, seguido por imagem após coloração baseada no protocolo de hemateina. O processo de coloração ocorreu em duas etapas e o realce de contraste desejado foi alcançado conforme o esperado após a coloração. Os resultados foram observados usando a visão geral microCT para mostrar estruturas anatômicas distintas, incluindo a vasculatura. A coloração foi homogênea dentro de todo o lóbulo de fígado de camundongo, ao contrário dos exemplos anteriores em grandes amostras de tecido hepático. O processo de imagem 3D permitiu acessibilidade a uma série de fatias de TC em planos arbitrários. Além disso, ao contrário da histologia 2D convencional (com tecido mole embebido em parafina), o tecido mole pode ser visto de diferentes ângulos.
O tecido foi investigado em seguida no nível subcelular com pedaços menores do mesmo lóbulo do fígado, que foram dissecados e analisados usando nanoCT. Os resultados visualizados mostraram regiões do volume de interesse (VOI), núcleos celulares dos hepatócitos e núcleos de outros tipos de células (células de Kupffer e células endoteliais sinusoidais). Estruturas inteiras pretas representavam a rede canalicular da bile (BC), enquanto os valores de cinza mais escuros indicavam o citoplasma da amostra de tecido hepático. A orientação da rede do BC também foi observada. O tecido foi então investigado com histologia convencional, usando lâminas microscópicas muito finas sem outra coloração além da coloração à base de hemateína aplicada. A técnica convencional confirmou da mesma forma a morfologia dos hepatócitos e de outros tipos de células (núcleos corados em roxo escuro), enquanto a rede BC estava manchada de branco.
Núcleos 3D e análise de diferentes núcleos celulares presentes no volume de interesse (VOI) do fígado de camundongo. Crédito: Relatórios Científicos , doi:https://doi.org/10.1038/s41598-018-36067-y.
Os cientistas comparativamente confirmaram a precisão da reconstrução de dados 3D no estudo com investigações anteriores. Quando o procedimento baseado em hemateína foi reaplicado em investigações convencionais de histologia 2D, os cientistas também aplicaram uma contra-coloração padrão, específico para eosina Y, ao citoplasma da célula no tecido. Nos resultados, os núcleos das células permaneceram roxos enquanto o citoplasma retomou a coloração rosa. Desta maneira, os cientistas autenticaram a capacidade de coloração baseada em hemateina específica de núcleos com histologia padrão também.
A demonstração da compatibilidade histológica do método de coloração à base de hemateína desenvolvido para microCT de raios-X e nanoCT com histologia 2D convencional. (A) Lâmina microscópica histológica representativa com uma espessura de 3 µm obtida da mesma amostra de lóbulo de fígado de camundongo após a aplicação de coloração à base de hemateina e incorporação em um bloco de parafina. Visualização clara dos núcleos das células de hepatócitos maiores e dos núcleos das células menores, como as células de Kupffer e SECs em roxo escuro e a rede BC exibida em branco. (B) A compatibilidade com a contra-coloração padrão de eosina Y foi mostrada em uma lâmina microscópica subsequente vista em (A). Os núcleos das células são mostrados em roxo próximo ao citoplasma em rosa, resultando em uma lâmina microscópica corada com H&E típica de uma amostra de tecido mole. Crédito: Relatórios Científicos , doi:https://doi.org/10.1038/s41598-018-36067-y.
O protocolo de coloração à base de hemateina auxiliou na visualização de TC de alta resolução para núcleos de células em tecidos moles na faixa sub-mícron, até agora não é possível com outros métodos de coloração que foram combinados com a tecnologia microCT. Estudos histopatológicos futuros podem ser capazes de eliminar procedimentos de preparação demorados e perda de amostra de tecido (como visto com histologia padrão) para obter fatias de tecido individuais por meio de investigação 3D de um VOI inteiro, conforme demonstrado no presente estudo. A capacidade de rastrear uma amostra maior para núcleos de células anormais pode ajudar os patologistas a identificar regiões de inflamação para avaliar a etiologia e a progressão da doença.
O protocolo de coloração é simples e reproduzível, adequado para coloração CT de órgão inteiro, juntamente com visualização 3D e em profundidade, análise não destrutiva de amostras de tecidos moles. Os agentes de coloração listados no protocolo são facilmente acessíveis, enquanto o protocolo adequado de raios-X combinados de CT permite maior sofisticação para análises de amostras de tecidos moles. As etapas do protocolo de coloração exigirão maior otimização com diferentes tipos de tecido e em diversas aplicações, incluindo histologia 3D, estudos de biologia estrutural e de desenvolvimento em laboratório.
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