O esquema representa uma grade de afinidade EM (quadrado cinza) revestida com moléculas adaptadoras (vermelho e azul escuro) que ancoram DLPs de rotavírus ativos (amarelo) à grade de afinidade. A imagem da microscopia crioeletrônica (EM) de transcrições ativas de DLPs revela fitas de RNA (fitas cinza) emergindo do capsídeo do vírus. As reconstruções de imagens tridimensionais de DLPs (azul claro) que produzem RNA ativamente revelam uma forte densidade dentro do núcleo viral. O diâmetro de cada reconstrução é de ~ 80 nm. Crédito:Deborah F. Kelly, Virginia Tech Carilion Research Institute, Virginia Tech.
Pesquisadores do Virginia Tech Carilion Research Institute (VTCRI) estão usando novas abordagens de imagem em nanoescala para lançar luz sobre as atividades dinâmicas dos rotavírus, patógenos importantes que causam diarreia com risco de vida em crianças pequenas. Uma vez que um rotavírus entra em uma célula hospedeira, ele derrama sua camada protéica mais externa, deixando para trás uma partícula de camada dupla (DLP). Essas DLPs são a forma do vírus que produz moléculas de RNA mensageiro, que são essenciais para o início da infecção.
Pesquisadores, Deborah Kelly, Ph.D. e Sarah McDonald, Ph.D., ambos os professores assistentes da VTCRI, instantâneos moleculares adquiridos de DLPs de rotavírus, no meio da produção de RNA viral, usando microscopia crioeletrônica (cryo-EM). A equipe que executava o trabalho também incluía alunos do terceiro ano de medicina, Joanna Kam e Andrew Demmert, da Escola de Medicina Virginia Tech Carilion, e pós-doutorado, Justin Tanner, Ph.D.
Para obter a melhor visualização possível dos detalhes em nanoescala de DLPs de rotavírus ativos, Kelly desenvolveu uma técnica que permitiu a visualização de mudanças na camada mais externa. Em conjunto com novas abordagens computacionais, os cientistas também foram capazes de detectar as características internas dos DLPs, que não haviam sido observados anteriormente. Interessantemente, as características internas do DLP mudaram de uma maneira que correspondeu às diferenças observáveis nos níveis de produção de RNA mensageiro viral.
Essas descobertas fornecem novos insights estruturais sobre a mecânica da síntese de RNA de rotavírus, que pode, por sua vez, fornecer informações sobre como esse processo viral ocorre após a infecção da célula hospedeira. Os resultados aparecem na última edição da revista. Tecnologia .
"O que é notável sobre este estudo é que fomos capazes de ver diferentes níveis de complexidade dentro das DLPs que se correlacionam com a síntese de RNA viral, "disse Kelly." Quando os vírus estavam ativos, suas estruturas externas moviam-se dinamicamente, de uma forma que se tornou menos organizada. Enquanto ao mesmo tempo, características fortes em seus núcleos internos tornam-se mais proeminentes. "
Uma abordagem inovadora chave usada pelo laboratório Kelly forneceu uma chance de visualizar um espectro mais amplo de estruturas virais. Ao examinar os DLPs anexados a anticorpos em uma superfície de grade estável, os pesquisadores puderam ver as nanomáquinas percorrendo seus processos naturais.
Kelly e McDonald também usaram um novo algoritmo de computador para categorizar os DLPs, independentemente, que evitou o viés do usuário nos cálculos experimentais. A abordagem computacional baseada em estatística classificou as amostras com base nos níveis de produção de RNA. Os resultados mostraram claramente que DLPs de rotavírus com uma camada protéica externa menos organizada tinham detalhes mais sólidos em seus núcleos internos. Essas DLPs também foram encontradas nas imagens crio-EM como estando próximas de mais fitas de RNA.
"Por muitos anos, os cientistas se preocuparam com resultados de alta resolução e não prestaram muita atenção à sutil diversidade que existe nas amostras de vírus, "disse McDonald, que também é Professor Assistente de Ciências Biomédicas e Patobiologia no Colégio Regional de Medicina Veterinária da Virginia – Maryland. "Mas essa diversidade pode ser um indicativo de como os vírus realmente funcionam dentro das células. Eles não são estáticos, mas de natureza dinâmica. "
"É um pouco contra-intuitivo, "disse Kelly, que também é Professor Assistente de Ciências Biológicas na Faculdade de Ciências da Virginia Tech. "Você poderia imaginar isso, se partes biológicas estivessem se movendo, então os recursos se dissipariam. Quando esses rearranjos ocorrem em um espaço tão confinado, Contudo, pode potencialmente levar a um nível mais alto de organização. E as mudanças coordenadas na parte externa dos vírus parecem habilitar esses processos. "
De acordo com Kelly, esses resultados fornecem uma nova visão sobre os processos de síntese de RNA de rotavírus e podem ser úteis em nossa compreensão da biologia viral em geral. Melhorando nossa compreensão do funcionamento interno do rotavírus, ela adicionou, também pode fornecer novos alvos para o desenvolvimento de tratamentos para doenças diarreicas induzidas por vírus.
