p MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs reguladores não codificadores que podem reprimir a expressão gênica pós-transcricionalmente e, portanto, são cada vez mais usados ​​como biomarcadores de doenças. A detecção de miRNAs pode ser árdua e cara, pois requerem amplificação, rotulagem e sondas radioativas. Em um relatório recente publicado em Avanços da Ciência , Arun Richard Chandrasekaran e colegas de trabalho do Instituto de RNA e do Departamento de Ciências Biológicas, na Universidade de Albany, Universidade Estadual de Nova York, relatado em uma única etapa, ensaio de detecção de microRNA não enzimático usando nanointerruptores de DNA conformacionalmente não responsivos. p Os cientistas chamaram o ensaio de 'miRacles, 'para abreviar' looping condicional ativado por micro-RNA de interruptores projetados '. O ensaio demonstrou subattomole e especificidade de nucleotídeo único usando uma leitura de eletroforese em gel de agarose. Nos experimentos, eles detectaram microRNAs celulares de extrações de RNA obtidas de músculos em diferenciação na escala de nanogramas. Os cientistas apresentaram uma configuração experimental econômica para detectar miRNAs em um período de horas para fornecer uma alternativa atraente para os métodos existentes de reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e Northern blotting para quantificar os materiais genéticos regulatórios.

p miRNAs podem regular muitos processos biológicos durante o desenvolvimento fisiológico normal e doenças, afetando a proliferação celular, diferenciação e apoptose in vivo. A expressão de miRNAs pode ser quantificada nos tecidos, células e fluidos corporais como biomarcadores estáveis ​​para eventos celulares e diagnóstico de doenças, destacando a importância de sua detecção. No entanto, A detecção de miRNA é um desafio devido à baixa abundância, tamanho pequeno e semelhanças na sequência. As biomoléculas compreendem aproximadamente 0,01 por cento do conteúdo total de RNA e as cópias individuais de mRNA por faixa de células podem variar amplamente. Adicionalmente, miRNAs em uma família podem diferir por um único nucleotídeo, enquanto miRNAs específicos podem ser regulados durante a doença e função celular regular. Como resultado, as estratégias de detecção de miRNA requerem alta especificidade e a capacidade de identificar corretamente algumas moléculas de uma amostra abundante com moléculas de RNA predominantes.

p Os métodos tradicionais para detecção de miRNA incluem Northern blotting, reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR), sequenciamento de última geração e hibridização baseada em microarray para separar o sinal do miRNA do ruído. Dos métodos especificados, O Northern blotting pode identificar diretamente miRNAs nativos, enquanto outros contam com métodos de rotulagem adicionais ou amplificação passo a passo, adicionando ao custo, complexidade e desempenho da detecção. Por exemplo, nanoestruturas de DNA inovadoras podem ser usadas para detecção de miRNA, onde vários grupos de pesquisa já combinaram nanoestruturas com nanopartículas, reações em cadeia de hibridização e nanofolhas de dichalcogeneto de metal de transição para permitir o processo.

p No presente trabalho, Chandrasekaran et al. desenvolveu um dispositivo baseado em DNA relativamente simples para resolver um desafio biomédico complexo. No ensaio miRacles, os cientistas usaram um 'reagente inteligente' composto de nanointerruptores de DNA racionalmente projetados para detecção simples e econômica de miRNA nativo, sem o uso de equipamento especializado no laboratório. Os nanointerruptores de DNA foram originalmente projetados como ferramentas para experimentos de biofísica de uma única molécula e, posteriormente, reconhecidos por sua capacidade de detectar e quantificar as interações biomoleculares usando eletroforese em gel. Os esforços de pesquisa colaborativa anteriores da mesma equipe de pesquisa focaram na detecção molecular para quantificar os níveis de proteína e detectar sequências de DNA sintético como uma prova de conceito.

p O presente trabalho expandiu estudos preliminares e conceitos para produzir detecção e quantificação de miRNA multiplexados prontos para o usuário. Os cientistas analisaram nanogramas de extratos de RNA celular em um curto espaço de tempo usando uma configuração experimental construída com materiais comuns de laboratório. Eles projetaram o nanoswitch de DNA como um duplex linear que formou um loop na presença da molécula de miRNA alvo. Para construir o nanoswitch, Chandrasekaran et al. usou a abordagem de origami de DNA por hibridização de oligonucleotídeos curtos complementares a um andaime de DNA de fita simples.

p Eles projetaram dois fios "detectores" distantes com saliências complementares a diferentes segmentos do miRNA alvo. Quando o miRNA é reconhecido e ligado ao construto, o switch foi reconfigurado do estado "desligado" linear para o estado "ligado" em loop. Eles quantificaram os dois estados usando eletroforese em gel de agarose padrão para detectar o sinal proveniente do nanoswitch em loop. O sinal foi amplificado apenas por um único miRNA de interesse, os resultados foram comparados favoravelmente com a técnica de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET).

p Para validar o conceito, a equipe de pesquisadores escolheu um miRNA alvo let-7b devido à sua família altamente conservada de mais de uma dúzia de miRNAs relacionados que variavam por um ou mais nucleotídeos. Esses miRNAs foram adequados devido ao seu papel crítico nas funções biológicas e desregulação em várias doenças humanas. Para eliminar a interferência e o ruído entre o nanoswitch e o alvo, o que levou à redução da intensidade do sinal em comparação com uma combinação perfeita, os cientistas redesenharam racionalmente os nanointerruptores. Para alcançar a especificidade perfeita, eles desestabilizaram a interação do lado que continha a incompatibilidade. Os resultados do estudo ilustraram a alta especificidade do ensaio assim desenvolvido, fornecendo uma resposta a um desafio chave na detecção de miRNA que culminou com uma alta relação sinal / ruído.

p A baixa abundância de miRNAs também exigiu alta sensibilidade de detecção, que os cientistas conseguiram otimizando o protocolo. Eles então realizaram experimentos semelhantes para duas outras variantes de miRNAs (miR-15 a e miR-206), resultando em níveis de detecção de subattomole para single-attomole. Por exemplo, para uma baixa concentração de uma amostra alvo (6 pM), o sinal aumentou por 4 horas, com poucas mudanças além desse período.

p miRNAs também são tipicamente estudados em culturas de células, amostras de tecido e fluidos corporais e prontamente processados ​​para coletar RNAs totais na escala do micrograma, junto com uma subfração de pequeno RNA. Por esta, Chandrasekaran et al. usaram células de mioblastos como um sistema modelo substituto de diferenciação muscular, com miR-206 como o alvo principal. Durante a cultura de células, eles identificaram miRNAs na diferenciação de músculos esqueléticos, onde a molécula miR-206 foi significativamente regulada positivamente durante a diferenciação tardia. Quando os cientistas coletaram as células musculares indiferenciadas e diferenciadas para extrair pequenos RNAs, eles confirmaram a diferenciação celular usando Western blots e conduziram imunocitoquímica para marcadores de diferenciação precoce e tardia miogenina (Myog) e cadeia pesada de miosina (MHC), respectivamente. Uma vez que miRNAs individuais compõem o nível de partes por milhão em massa de RNAs totais, detectar miRNAs é tão desafiador quanto encontrar uma agulha em um palheiro. Para validar o ensaio para detecção biológica, Portanto, Chandrasekaran et al. começou com a pequena subfração de RNA menos complexa. Ao usar o nanoswitch alvo miR-206, os cientistas observaram um aumento progressivo na expressão do miR-206 em pequenos RNAs entre amostras indiferenciadas e amostras diferenciadas por 1-4 dias.

p Uma vez que vários mRNAs também podem alterar sua expressão durante diferentes estágios celulares ou de doença, o fenômeno exigia recursos adicionais de detecção. Para fazer isso na configuração experimental, Chandrasekaran et al. usou a programabilidade de nanointerruptores e desenvolveu um sistema de multiplexação capaz de detectar vários miRNAs da mesma amostra. Eles colocaram as fitas do detector em locais desejados da estrutura de DNA, resultando em loops de tamanhos diferentes quando ligados ao miRNA alvo. O tamanho do loop do nanointerruptor determinou assim a migração do gel, resultando em uma banda única no gel para detecção precisa. Para o experimento, os cientistas escolheram quatro miRNAs presentes nas células musculares; miR-206, miR-125b, miR-24 e miR-133-3p e um miRNA de controle negativo; miR-39 específico para a espécie Caenorhabditis elegans.

p Dentro de 50 ng de pequenos RNAs, os cientistas detectaram os quatro miRNAs em vários níveis de expressão, enquanto confirma nenhuma detecção com o controle negativo. A estratégia de multiplexação permitiu aos cientistas comparar diretamente os níveis de miRNA em uma única amostra, sem rotulagem ou amplificação. No total, o trabalho forneceu um passo adicional na direção de expandir o rendimento do ensaio miRacles. A capacidade pode ser expandida para acomodar mais miRNAs por switch também.

p Desta maneira, Chandrasekaran et al. substancialmente avançou de sua detecção de prova de conceito preliminar de sequências de DNA sintéticas; para estabelecer, caracterizar e otimizar um ensaio de detecção de miRNA pronto para uso com extratos biológicos. O trabalho demonstrado foi um primeiro exemplo de uso de nanointerruptores de DNA para detectar miRNAs de uma amostra biológica verdadeira. Enquanto o desempenho do ensaio de miRNA foi competitivo em comparação com outras técnicas comumente usadas, a seletividade de 1 nucleotídeo visto no presente trabalho foi difícil de realizar com os métodos existentes. A sensibilidade dos miRacles também superou o Northern blotting e os microarrays. O ensaio pode medir miRNAs sem a necessidade de amplificação, com protocolos mais simples e sem o erro adicional de processamento de amostra extra. O protocolo simplesmente misturou os nanointerruptores com o líquido de amostra para eletroforese em gel, para produzir resultados de alta qualidade no laboratório. O trabalho de pesquisa é potencialmente transferível de amostras biológicas para clínicas para diagnosticar e monitorar doenças.

p Mais importante, o presente trabalho alinha-se com o conceito mais amplo de ciência econômica; uma visão promissora de ciência econômica que já produziu soluções de baixo custo para técnicas de centrifugação de sangue e purificação de água em engenharia biomédica. Chandrasekaran et al. pretendem continuar a contribuir para a tendência emergente na ciência, interrompendo a relação custo / desempenho existente para fornecer acesso em larga escala a métodos simples de detecção de miRNA com reagentes inteligentes de leitura e mistura. p © 2019 Science X Network