Os nós são ferramentas indispensáveis ​​para atividades humanas como velejar, pesca e escalada, (para não mencionar, Amarrando sapatos). Mas dar um nó em uma fita de DNA semelhante a uma lacuna, medindo apenas bilionésimos de um metro de comprimento, requer paciência e conhecimentos altamente especializados.

Hao Yan, um pesquisador da ASU, é uma mão experiente neste campo delicado e exótico, operando na encruzilhada da nanotecnologia e das belas-artes.

Em nova pesquisa publicada no jornal Nature Communications , Yan e seus colegas Fei Zhang, Xiaodong Qi e outros descrevem um método para persuadir segmentos de DNA de fita simples em estruturas complexas com nós 2 e 3-D.

Os resultados representam um importante avanço no campo acelerado da nanotecnologia de DNA, em que a molécula da vida é usada como um material de construção estrutural para uma vasta gama de configurações minúsculas. Entre eles estão dispositivos robóticos minúsculos, aplicações fotônicas, sistemas de entrega de drogas, portas lógicas, bem como aplicações diagnósticas e terapêuticas.

"As estruturas de DNA com nós demonstradas neste trabalho exibem uma complexidade topológica sem precedentes, muito além do que foi alcançado antes de usar a dobradura de fio único, "Yan diz." De fato, não é apenas incrível, mas também surpreendente que o DNA e o RNA de fita simples podem se enredar em suas próprias cadeias e encontrar uma maneira de formar tais estruturas com nós, dado o fato de que o único fio tem que se entrelaçar com tantos emaranhados. "

Yan dirige o Centro de Biodesign para Design Molecular e Biomimética e é o Professor Distinto Martin D. Glick na Escola de Ciências Moleculares da ASU.

Trazendo DNA para a dobra

O novo estudo envolve inovações no campo do origami de DNA, que, como o nome implica, usa ácidos nucléicos como DNA e RNA para dobrar e se automontar em formas complexas. Isso ocorre quando as bases de nucleotídeos complementares no alfabeto de 4 letras do DNA entram em contato e se ligam, de acordo com um regime estrito:as bases C sempre emparelham com G e as bases A sempre emparelham com T.

Na natureza, cadeias de ácidos nucléicos fornecem o código necessário para fazer proteínas complexas. Essa biologia básica fornece a base para toda a vida terrena. Aproveitando as propriedades simples de emparelhamento de bases do DNA, é possível projetar estruturas que se automontarão no laboratório. O método foi aplicado a formas de DNA de fita simples e dupla, resultando em nanoestruturas de complexidade e sofisticação crescentes.

Embora o origami de DNA tenha feito avanços surpreendentes desde o seu início, uma inovação técnica tem sido extremamente difícil de alcançar. Até agora, a criação de estruturas complexas com nós no DNA de uma forma previsível e programável tem iludido os pesquisadores.

O novo trabalho supera esse obstáculo, estabelecer regras de design precisas que permitem segmentos de fita simples de DNA (ou RNA) variando de 1800-7500 nucleotídeos para formar nanoestruturas semelhantes a nós com números de cruzamento (onde a fita de DNA se entrelaça dentro e fora de seu próprio comprimento) variando de 9 a 57 .

O grupo demonstrou ainda que essas nanoestruturas de ácido nucleico podem ser replicadas e amplificadas, tanto em condições de laboratório quanto em sistemas vivos.

Nós da natureza

Estruturas atadas, como aqueles que Yan fabricou, (mas muito mais simples do que os sintéticos), têm correlatos no mundo natural. Eles foram observados no DNA e proteínas e geralmente se formam durante a replicação e transcrição, (quando uma sequência de DNA é copiada para o RNA mensageiro). Eles também podem ocorrer nos genomas de fagos - vírus que infectam células bacterianas.

No entanto, a construção de nós moleculares em escala nanométrica, exibir geometrias bem definidas e consistentes requer enorme controle e precisão. Como acontece, ácidos nucléicos como o DNA são ideais para o desenho e a síntese de tais nós moleculares.

Anteriormente, comprimentos de DNA de fita dupla têm sido usados ​​para construções em nanoescala, com a adição de peças curtas ou "fios básicos" para unir as estruturas resultantes. O novo estudo, em vez disso, usa um único comprimento de DNA projetado para envolver-se de uma forma precisa, seqüência pré-programada de etapas.

Uma vez que as nanoestruturas de DNA com nós se montam com sucesso, eles são fotografados usando microscopia de força atômica. O cálculo cuidadoso permite que os pesquisadores otimizem as vias de dobramento para produzir o maior rendimento para cada estrutura sintética. O uso de DNA de fita simples em vez de dupla permite que as estruturas sejam produzidas em abundância a um custo muito mais baixo.

Uma abordagem de cadeia única abre a porta para o design de nanoarquiteturas com funções bem definidas, que pode ser produzida por meio de rodadas sucessivas de evolução in vitro, onde os atributos desejados são selecionados em um processo repetitivo de refinamento. Avançar, a abordagem descrita no novo estudo fornece uma plataforma geral para o projeto de estruturas moleculares de tamanho aumentado e complexidade sem precedentes, abrindo caminho para avanços em nanofotônica, entrega de drogas, análise crio-EM e armazenamento de memória baseado em DNA.

DNA Designer (e RNA)

Para um dos projetos de nó iniciais, a estratégia que Yan e seus colegas desenvolveram envolveu o enfiamento de uma única fita de DNA ou RNA através de si mesmo 9 vezes de acordo com uma sequência pré-programada, demonstrando que o novo método é capaz de produzir formas geométricas intrincadas que são programáveis, replicável e escalável.

A estratégia de design foi posteriormente expandida para incluir estruturas de RNA de fita simples e nós de DNA 3-D, cujas formas foram reconstruídas usando uma técnica conhecida como microscopia eletrônica de transmissão criogênica, confirmando seu dobramento adequado nas formas desejadas.

"Um dos desafios deste trabalho é como aumentar o rendimento da montagem de estruturas com muitos nós." Disse Fei. Ao contrário das nanoestruturas clássicas de DNA, os nós de fita simples são menos tolerantes em termos de ordem precisa de dobra devido à complexidade topológica. Se um único cruzamento for dobrado incorretamente durante o processo, o erro dificilmente será corrigido automaticamente e a maioria das dobragens incorretas permanecerá na estrutura concluída. "Desenvolvemos uma estratégia de dobramento hierárquico para orientar a formação correta de nós. Comparamos a eficiência de dobramento de um nó com 23 cruzamentos usando diferentes caminhos de dobramento. As imagens AFM mostraram um aumento dramático no rendimento de dobramento de estruturas bem formadas de 0,9 % a 57,9% aplicando o caminho de dobra hierárquico otimizado. " Fei acrescentou.

As regras de design usadas para otimizar os caminhos de dobra são baseadas no número de pontos de cruzamento, o comprimento do DNA e o número de pares de bases na estrutura projetada. Três regras principais foram estabelecidas. Primeiro, verificou-se que os caminhos de dobra linear são preferíveis aos caminhos ramificados. Segundo, a seção desdobrada de uma fita de DNA não deve passar por ela mesma nos estágios iniciais, quando a fita ainda é longa. Finalmente, bordas da forma desejada que têm três cruzamentos devem dobrar antes daquelas com duas cruzes.

Seguindo a estratégia de design, a equipe foi capaz de criar nós de DNA mais complexos com o aumento do número de cruzamentos.

Cadeias mais longas de DNA de fita simples representam desafios únicos para o projeto de nanoestruturas programadas devido à maior probabilidade de auto-complementaridade não intencional das bases que constituem a cadeia. Uma estrutura de nó de DNA ostentando 57 nós cruzados montados com sucesso, embora com menor rendimento e menos precisão. Quando o número de cruzamento foi aumentado para 67, o rendimento caiu significativamente e as estruturas resultantes, fotografado por AFM, mostrou mais erros de montagem.

O estudo relata os maiores nós de DNA já montados, formado a partir de até 7,5k bases, apresentando as topologias mais complicadas, com até 57 regiões de cruzamento. As sequências de DNA de fita simples podem ser produzidas em massa em células vivas para maior eficiência a um custo menor. Em última análise, Nanoestruturas de DNA de funções diversas podem ser formadas dentro das células, inovações a serem perseguidas em trabalhos futuros.