A fluorescência é uma ferramenta incrivelmente útil para a biologia experimental e ficou mais fácil de usar, graças ao trabalho de um grupo de pesquisadores da Universidade de Chicago.

O grupo criou uma nova ferramenta como parte de uma aula de laboratório dentro do programa de pós-graduação em Ciências Biofísicas da Universidade de Chicago, permitindo que seus usuários se concentrem no espectro de estruturas específicas dentro de amostras.

"A maior parte do trabalho foi feito por alunos de pós-graduação durante o primeiro semestre, "disse Adam Hammond, diretor de currículo e conferencista sênior do programa de Ciências Biofísicas do Gordon Center for Integrative Sciences. "Seu entusiasmo e criatividade tornaram este projeto possível."

Como o grupo relata esta semana no jornal Revisão de instrumentos científicos , da AIP Publishing, o objetivo de sua instrumentação é observar o espectro de luz que vem de parte de uma amostra em um microscópio - mas não a amostra inteira.

"O valor de um microscópio é que ele permite que você observe as variações dentro de uma amostra, "Hammond explicou." Queríamos poder perguntar, 'qual é o espectro daquela estrutura específica aqui?' Este não é um novo desejo e instrumentos que podem fazer isso existir, mas nenhum, até onde sei, tão simplesmente quanto o nosso. "

Durante seu primeiro ano na pós-graduação, Peter Dahlberg, primeiro autor do artigo que agora está na Universidade de Stanford, na Califórnia, tenho que construir um microscópio de excitação seletiva. "Subconscientemente, Acho que a ideia começou então, "disse ele." Por que não fazer a mesma coisa, mas ao contrário? "

Como funciona a ferramenta do grupo? Primeiro, ele divide a luz que vem de uma amostra. Metade vai para uma câmera para imagens normais e a outra metade vai para um espectrômetro. Mas antes que chegue ao espectrômetro, essa metade passa por alguns componentes ópticos que permitem aos usuários escolher qualquer parte arbitrária da imagem e bloquear todo o resto.

"Não há nada complicado sobre esses componentes ópticos - um modulador de luz espacial (SLM) entre polarizadores cruzados, "Hammond disse." SLMs são comuns agora, com pelo menos três em muitos projetores digitais modernos. Eles têm uma matriz de pixels que pode, cada um, manipular a fase da luz que passa por eles. "

Embora existam vários truques que você pode fazer com um SLM, o grupo está usando o mais simples.

"Focamos a imagem da amostra no SLM e mudamos a fase apenas dos pixels dos quais queremos obter um espectro, "ele continuou." A luz deslocada passa por um segundo polarizador; tudo o mais é bloqueado. Em seguida, essa luz é coletada e pode ser enviada para qualquer tipo de instrumento óptico de sua escolha. Agora, nós o enviamos para um pequeno espectrômetro de UV / Vis para obter um espectro completo. "

O instrumento do grupo é, possivelmente, melhor resumido como uma "ferramenta robusta". Seus conceitos e componentes simples podem ser facilmente adaptados para muitos propósitos diferentes e adicionados aos microscópios existentes de forma fácil e econômica.

"Decidimos construí-lo para um uso específico:para medir a mudança espectral de indicadores fluorescentes, "Hammond disse." Nós realmente não pensamos em torná-lo versátil ou como organizar o SLM e os polarizadores quando começamos. Mas tivemos uma série de realizações divertidas ao longo do caminho. "

Uma dessas constatações foi que seu instrumento também poderia ser usado para medições de absorbância.

"Muitas vezes, as amostras mais importantes são minúsculas e difíceis de criar ou purificar, como formas de cristal, - disse ele. - É um trabalho árduo purificar os dois tipos um do outro em quantidades suficientes para encher uma cubeta. Quando você coloca a mistura em uma lâmina de microscópio, fica mais fácil. Os cristais podem ser medidos um de cada vez, e o mesmo pode acontecer com as células que expressam cromóforos variáveis ​​(moléculas responsáveis ​​pela cor). Isso abre uma área totalmente nova que não fazia parte do nosso plano original. "

O instrumento do grupo pode "obter todo o espectro de uma ou mais regiões de interesse definidas pelo usuário, enquanto captura simultaneamente imagens de fluorescência padrão de todo o campo de visão, "Hammond disse." Então, o que você pode fazer com isso depende da amostra. Estamos usando agora para acompanhar sondas fluorescentes para pH e cálcio. Mas um exemplo de uma aplicação muito diferente é sua capacidade de identificar microorganismos individuais dentro de uma amostra mista por sua impressão digital de absorbância. "

O que vem a seguir para os pesquisadores?

"Usando uma fonte de excitação pulsada, o tempo de vida de fluorescência de uma sonda pode ser medido a partir de uma região selecionada de interesse, "disse Hammond." Uma aplicação potencial interessante está no campo da neurociência para resolver potenciais de ação única com corantes que são sensíveis ao potencial de membrana. As medições do tempo de vida da fluorescência fornecem uma vantagem sobre as medições diretas da fluorescência porque são independentes da concentração da sonda. "