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  • Therapeutics-on-a-chip (TOC):fabricação de proteínas sintéticas para pontos de tratamento terapêuticos
    p Visão geral do sistema de síntese de proteínas livres de células. O sistema de síntese é feito de três componentes:lisado, solução de energia, e DNA de plasmídeo. O lisado é coletado de células de E. coli por lise celular e preparado por ultracentrifugação. A solução energética é composta por trifosfatos de nucleosídeo (NTPs), aminoácidos, enzimas, e cofatores. O DNA de plasmídeo é feito inserindo o gene de interesse expresso em um cassete de expressão. Os três componentes são combinados e incubados para sintetizar a proteína de interesse. Crédito:Microsystems &Nanoengineering, doi:10.1038 / s41378-019-0051-8

    p Proteínas terapêuticas são candidatos a medicamentos baseados em proteínas, desenvolvidos por bioengenharia em laboratório para aplicações farmacêuticas e clínicas. Com base em sua farmacocinética, os candidatos podem ser divididos em grupos que (1) substituem uma proteína defeituosa ou anormal, (2) aumentar um caminho existente in vivo, (3) fornecer uma nova função ou atividade in vivo, (4) interferir com as atividades de uma molécula ou organismo e (5) entregar proteínas ou compostos encapsulados, incluindo, drogas citotóxicas, radionuclídeos ou proteínas efetoras. p Em um estudo recente publicado em Microsistemas e Nanoengenharia , Travis W. Murphy e colegas de trabalho dos Departamentos de Engenharia de Sistemas Químicos e Biológicos da Virginia Tech desenvolveram um modelo de baixo custo, plataforma de purificação e sintética point-of-care para engenharia de proteínas. Eles construíram um dispositivo "Therapeutics-on-a-Chip (TOC)" de microfluídica integrado para livre de células, síntese de proteínas terapêuticas e purificação de proteínas terapêuticas em uma única configuração.

    p A capacidade de sintetizar proteínas terapêuticas em um ambiente de ponto de atendimento, pode diminuir rapidamente os custos de armazenamento e transporte durante a distribuição global em regiões com poucos recursos e contribuir para o conceito de ciência econômica. A maioria das proteínas é atualmente produzida usando sistemas de cultura de células, como a Escherichia coli recombinante, fermento, células de mamíferos e células de plantas para fabricação em grande escala, depois disso, eles são distribuídos globalmente a partir de fundições centralizadas. Contudo, a meia-vida limitada dessas proteínas sintéticas requer armazenamento em baixa temperatura e instalações de transporte que são um desafio para pacientes que vivem em regiões remotas e de poucos recursos.

    p No presente trabalho, Murphy et al. primeiro demonstrou os princípios de funcionamento do dispositivo expressando e purificando uma proteína repórter - proteína fluorescente verde. Seguido pelo uso de TOC para produzir cecropina B - um peptídeo antimicrobiano amplamente utilizado para controlar doenças de biofilme. Os cientistas sintetizaram e purificaram com sucesso a cecropina B para produzir uma concentração de 63 ng / µL em seis horas, com pureza de 92 por cento, seguido pela confirmação de suas propriedades antimicrobianas com um ensaio de inibição de crescimento. A tecnologia TOC fornece uma nova plataforma para síntese e purificação de proteínas de ponto de atendimento para terapêuticas clínicas acessíveis.

    p a) Uma imagem microscópica do módulo de síntese. b) As etapas para a síntese:início da síntese e síntese em estado estacionário. c Western blotting de GFP produzido no sistema CFPS e o rendimento da proteína com diferentes concentrações do modelo de plasmídeo. O anticorpo monoclonal primário de camundongo 6 × His e o anticorpo secundário de cabra anti-IgG de camundongo conjugado com HRP (H + L) foram usados ​​para detectar a proteína alvo. As concentrações listadas são as concentrações no volume final da reação. Crédito:Microsystems &Nanoengineering, doi:10.1038 / s41378-019-0051-8

    p Os dispositivos de última geração atualmente em uso para síntese de proteína de ponto de uso incluem um sistema do tamanho de um refrigerador que abrange um ciclo de produção-purificação de dois dias para fabricar 800 doses de um medicamento por dia. No entanto, o custo de capital associado a tal sistema não é viável no mundo em desenvolvimento, onde a necessidade de produção rápida de terapêutica em massa para distribuição supera a produção de terapêutica em massa para armazenamento de longo prazo. No sistema TOC desenvolvido por Murphy et al. os cientistas realizaram a síntese point-of-care e a purificação de proteínas terapêuticas usando um processo de síntese de proteínas livres de células (CFPS). Neste sistema, proteínas recombinantes foram expressas sem o uso de células vivas, adequado para produção em ponto de atendimento, onde os materiais de partida liofilizados podem permanecer estáveis ​​durante o armazenamento em uma ampla faixa de temperatura.

    p Entre as proteínas examinadas no estudo, A cecropina B tem uma concentração inibitória mínima de 9,5 ng / µL para exercer efeitos antimicrobianos. Usando a configuração microfluídica, os cientistas combinaram a síntese e a purificação de proteínas para produzir um peptídeo antimicrobiano cecropina B em uma dose clinicamente relevante (63 ng / µL). A produção de fluxo contínuo na configuração foi concluída em três fases de desenvolvimento:

    1. Projeto de reator de síntese de proteína livre de células (CFPS)
    2. Projeto do reator de purificação (P)
    3. Projeto do sistema CFPS + P integrado
    p Murphy et al. usaram moldagem de polidimetilsiloxano (PMDS) baseada em litografia suave para fabricar os dispositivos; construção de multicamadas usando válvulas micromecânicas.

    p Durante a primeira fase do projeto do dispositivo no reator CFPS, os cientistas fabricaram um chip microfluídico de canal serpentino, semelhante a estudos anteriores para a síntese de proteínas no chip. O dispositivo microfluídico continha entradas conectadas a uma bomba de seringa colocada na fase de aquecimento de um microscópio, onde três entradas receberam (1) lisado celular, (2) tampão de reação CFPS e um (3) molde de DNA no longo canal de serpentina (aproximadamente 130 cm) com uma saída. Os cientistas alimentaram os três componentes da reação a uma taxa de fluxo combinada de 0,15 µL / min acionada por uma bomba de seringa por um tempo de residência de 1,5 horas. Eles aqueceram o reator com um aquecedor de estágio (37 graus C) e modelaram a configuração usando o software COMSOL Multiphysics para verificar a mecânica do dispositivo, para uma ótima mistura e reação baseada na difusão no chip. Para validar os princípios de operação do dispositivo, Murphy et al. sintetizou a proteína repórter, GFP usando uma variedade de modelos de DNA. O sistema produziu volumes de proteína em um tempo de reação constante.

    p Purificação de proteínas em câmara microfluídica. a) Uma imagem microscópica do módulo de purificação. b) Visão geral do procedimento de purificação (incluindo carregamento de grânulos, formação de leito, adsorção de proteínas, lavando, e eluição) por três fluxos de trabalho diferentes. O fluxo de trabalho 1 usa adsorção de fluxo e etapas de lavagem. O fluxo de trabalho 2 usa adsorção de fluxo e lavagem oscilatória. O fluxo de trabalho 3 usa adsorção e lavagem oscilatória. Azul escuro denota uma válvula fechada, onde transparência denota uma válvula aberta. c) SDS-PAGE de GFP purificado pelo chip de purificação. M (marcador); D (esgotado):mistura de reação CFPS após a absorção do grânulo; R (Removido):contaminantes removidos no tampão de purificação; P (Produto):GFP purificado no tampão de eluição. d) A otimização da etapa de purificação. A otimização foi conduzida examinando 4 condições. (1) volume de esferas de Ni-NTA de 5 ou 8 µl; (2) Tween-20 a 0,5% adicionado aos tampões de purificação e eluição. (3) Fluxos de trabalho diferentes. (4) Tempos de adsorção oscilatória diferentes. Crédito:Microsystems &Nanoengineering, doi:10.1038 / s41378-019-0051-8

    p Na segunda fase, Murphy et al. projetou um dispositivo microfluídico para purificação de proteínas com base em um protocolo de adsorção e lavagem de alta eficiência, conforme demonstrado pela mesma equipe de pesquisa anteriormente. Eles operaram o dispositivo usando válvulas solenóides para controlar a válvula micromecânica única e os pulsos de pressão oscilatória associados para realizar a purificação de proteínas em quatro etapas principais.

    p No fluxo de trabalho, as etapas foram (1) carregamento do cordão, (2) adsorção de proteína, (3) lavagem e (4) eluição. Para otimizar o processo, os cientistas dividiram o método em três fluxos de trabalho diferentes. Murphy et al. em seguida, variou as condições que afetam os resultados da purificação de proteínas para atingir a pureza do produto de até 98,5 por cento, com um rendimento de 54,6 por cento do produto, superando outros métodos.

    p O sistema integrado para síntese e purificação de proteínas livres de células. a Micrografia da plataforma CFPS + P integrada. b Visão geral da configuração da plataforma CFPS + P integrada. O sistema consiste em válvulas solenóides controladas por computador e bombas de seringa conectadas a um dispositivo microfluídico colocado em um estágio de aquecimento. Crédito:Microsystems &Nanoengineering, doi:10.1038 / s41378-019-0051-8.

    p Na fase três, os cientistas desenvolveram uma plataforma microfluídica integrada com síntese e purificação de proteínas livres de células (CFPS + P) para automação. Eles combinaram um reator de fluxo contínuo e um dispositivo de purificação em lote, embora os dois processos não fossem intrinsecamente compatíveis um com o outro para começar. Para conseguir compatibilidade adequada, eles conectaram os dois processos usando um reservatório de tubo que armazenava a proteína produzida continuamente em um chip, antes da purificação. Todos os aparelhos usados ​​no estudo para operar o sistema microfluídico podem caber no tamanho de uma pasta, tornando-o altamente portátil, sistema de produção de proteínas terapêuticas.

    p No total, o chip CFPS + P totalmente integrado continha cinco etapas principais, incluindo, priming, síntese proteíca, adsorção de proteínas, lavagem e eluição. Em uma sexta etapa, os cientistas providenciaram uma atualização de contas. Murphy et al. usou o canal de síntese serpentina como o módulo de síntese individual, depois de sintetizar a quantidade desejada de proteína, eles encerram a configuração do módulo de purificação para iniciar o processo subsequente de purificação. Para testar o fluxo de trabalho da configuração, os cientistas usaram o GFP e alcançaram uma pureza de 98 por cento.

    p ESQUERDA:Visão geral e operação da plataforma integrada de purificação e síntese de proteínas livres de células em 5 etapas principais:a) iniciação, b) síntese de proteínas, c) adsorção de proteínas, lavando, e eluição, com uma 6ª etapa opcional de atualização do grânulo. Crédito:Microsystems &Nanoengineering, doi:10.1038 / s41378-019-0051-8. À DIREITA:Síntese e purificação de cecropina B usando dispositivo microfluídico CFPS + P integrado. a) Tricina-PAGE da cecropina B sintetizada e purificada pelo chip integrado. M (marcador); D (esgotado):mistura de reação CFPS após a absorção do grânulo; R (removido):contaminantes removidos no tampão de purificação; P (produto):AMP purificado no tampão de eluição. b) Otimização da recuperação de cecropina B usando múltiplos ciclos de adsorção. c) Ensaios de inibição de crescimento de E. coli realizados em triplicado, usando o produto de proteína (eluição) após três ciclos de adsorção / eluição por nosso dispositivo em comparação com os padrões de cecropina B de diferentes concentrações (0-100 ng / μl, denotado como STD 0-100). OD600 foi medido a cada 30 min durante 18 h. Foi utilizada a eluição com concentração de 27 ng / μl em 60 μl de solução. Linhas de tendência que representam a média de três tentativas são adicionadas para guiar o olho. Crédito:Microsystems &Nanoengineering, doi:10.1038 / s41378-019-0051-8.

    p Após a otimização do fluxo de trabalho CFPS + P usando GFP, os cientistas usaram a mesma configuração para otimizar as condições para sintetizar a cecropina B. Seguindo as etapas de expressão, purificação, eletroforese e coloração na configuração, Murphy et al. confirmou a produção e purificação bem-sucedidas de cecropina B e recuperou proteínas solúveis para eluir 63 ng / µL, com pureza de 92 por cento. Eles então testaram a bioatividade da cecropina B em relação a E. coli inibição para demonstrar a atividade antibiótica bem-sucedida, inibindo o crescimento bacteriano.

    p Desta maneira, proteínas terapêuticas sintetizadas e purificadas usando a configuração microfluídica demonstraram supressão ativa e eficaz do crescimento bacteriano. O sistema de baixo custo pode ser integrado ativamente em ambientes de poucos recursos para a ciência econômica. Murphy et al. pretende automatizar completamente o sistema com base em otimizações contínuas no futuro. Eles imaginam aplicações da configuração para projetar uma variedade de proteínas terapêuticas diversas para produção de ponto de atendimento com custo reduzido. p © 2019 Science X Network




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