• Home
  • Química
  • Astronomia
  • Energia
  • Natureza
  • Biologia
  • Física
  • Eletrônicos
  •  science >> Ciência >  >> Física
    Estendendo espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica (EPR) para cristais únicos de proteína de volume de nanolitro

    A microhélice auto-ressonante. (A) Um microhélix fabricado de cinco voltas enrolado em torno de um capilar de 0,4 mm de diâmetro externo. Durante a fabricação, o microhelix é enrolado firmemente em torno de uma broca de 0,4 mm e colado dentro de um cilindro Rexolite. A broca é removida, e a cola pode secar por vários dias. O conjunto microhelix é colocado em (B) um conjunto de acoplamento e suporte, que inclui um microcoupler planar. (C) O microcoupler planar consiste em um casamento de impedância stripline com um laço de acoplamento indutivo. SMA, Versão subminiatura A. (D) Simulações de modelagem de elementos finitos do campo magnético de micro-ondas, normalizado para alimentação de entrada, em 9,5 GHz mostram uma região ativa de boa homogeneidade de campo magnético em uma altura de 0,8 mm. O campo magnético de microondas medido de 3,2 G / W1 / 2 corresponde a um pulso de 20 ns π / 2 a aproximadamente 20 mW. Dimensões do microhelix, onde a auto-ressonância é determinada pela capacitância formada entre cada volta e a indutância dos enrolamentos, são mostrados. A frequência pode ser ajustada durante a fabricação pelo número de voltas, o tom das voltas, ou o diâmetro interno. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.aay1394

    Os bioquímicos podem usar ressonância paramagnética eletrônica (EPR) em cristais únicos de proteínas para determinar a estrutura eletrônica final dos intermediários de proteínas paramagnéticas e investigar o tensor magnético relativo a uma estrutura molecular. O método é, Contudo, retido por dimensões de cristal de proteína típicas (0,05 a 0,3 mm) que não fornecem intensidade de sinal suficiente durante a cristalografia de proteína. Em um novo estudo sobre Avanços da Ciência , Jason W. Sidabras e uma equipe de pesquisa interdisciplinar nos departamentos de Conversão de Energia Química, Fotobiotecnologia, O Instituto de Biologia e Física Experimental da Alemanha apresentou uma microhélice auto-ressonante de microondas para quantificar amostras de nanolitros. Os cientistas implementaram a técnica em um espectrômetro EPR comercial de banda X (freqüência média; 9,5 GHz). O microhelix auto-ressonante forneceu uma melhoria sinal-ruído medida em comparação com outros ressonadores EPR comerciais. O trabalho possibilita técnicas avançadas de EPR para estudar cristais únicos de proteína para cristalografia de raios-X, sem exclusões ou desafios relacionados ao tamanho. Para demonstrar o método, Sidabras et al. usou proteína de cristal único [FeFe] -hidrogenase (de Clostridium pasteurianum ) com dimensões de 0,3 mm por 0,1 mm por 0,1 mm.

    Autor principal Jason W. Sidabras, atualmente é Marie Sklowdowska-Curie Actions Fellow no Max Planck Institute for Chemical Energy Conversion, na Alemanha, comentou ainda sobre o trabalho realizado com os colegas pesquisadores Professor Wolfgang Lubitz e Dr. Edward J. Reijerse. "Embora tenhamos começado com [FeFe] -hidrogenase aqui, há anos tentamos investigar a dinâmica do EPR de cristal único e a tecnologia atual não se limita apenas aos metais de transição. O método definido no estudo é aplicável para monitorar qualquer atividade enzimática dentro de um intermediário de proteína estável. "Ele observou ainda o objetivo de usar a tecnologia para reduzir os custos existentes da tecnologia de EPR de pulso e substituir amplificadores de alta potência caros para a ciência frugal (economicamente estratégias econômicas em ciências).

    Os cientistas normalmente usam a espectroscopia EPR para investigar o ciclo catalítico de enzimas redox que contêm intermediários paramagnéticos e obter informações sobre a estrutura eletrônica e geométrica de um sítio enzimático ativo. Geralmente, a fim de realizar experimentos de EPR em proteínas, pesquisadores preparam uma solução congelada (concentração entre 0,1 a 1 mM) e colocam um volume (200 µl) em uma cavidade de microondas para obter interações magnéticas em um local ativo, com visão limitada da estrutura eletrônica. Para resolver totalmente os parâmetros de interação magnética do tensor, eles devem realizar experimentos EPR de cristal único onde tensores de interação magnética podem ser combinados com cristalografia de raios-X para demonstrar a geometria da proteína e entender os mecanismos catalíticos das enzimas. Contudo, O EPR de cristal único raramente é aplicado a sistemas de proteínas devido aos desafios de se obter cristais com volumes e tamanhos apropriados. Muitas proteínas na faixa de 0,05 a 0,3 mm são muito pequenas para análise usando instrumentação comercial de EPR.

    ESQUERDA:A estrutura molecular do sítio ativo da [FeFe] -hidrogenase, o H-cluster. Em destaque estão os ferros proximal e distal, Fep e Fed, respectivamente, o ligante de cianeto (CN-d), e o ligante ADT. S, amarelo; Fe, laranja; N, azul; C, bronzeado; O, vermelho. A estrutura é do Protein Data Bank (PDB) ID 4XDC. À DIREITA:Solução congelada EPR em uma amostra de 85 nl de volume na banda X. Três experimentos EPR realizados com uma microhélice auto-ressonante de 0,4 mm de diâmetro interno. São mostrados (A) onda contínua (CW), (B) varredura rápida não-adiabática real (Re.) E imaginária (Im.) (NARS), e (C) experimentos ESE EPR de dois pulsos de campo varrido do radical tirosina D (Y ∙ D) no fotossistema II com 85 nl de amostra de solução congelada a uma temperatura de 80 K. Pseudo-modulação calculada de MDIFF (diferença móvel) de 0,5 mT é mostrado para os experimentos NARS e ESE de varredura de campo para comparar diretamente com o experimento EPR de onda contínua. O tempo total para os experimentos foi 49, 55, e 45 min, respectivamente. A relação sinal-ruído é calculada e tabulada. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.aay1394.

    Para melhorar a sensibilidade do EPR para estudar cristais únicos, normalmente na banda X, os pesquisadores devem abandonar o projeto da cavidade de micro-ondas e avançar em direção a ressonadores de pequeno volume na faixa de micro-ondas. A estratégia pode facilitar volumes de amostra reduzidos de 200 para 20 µl usando um ressonador de lacuna (LGR) e reduções adicionais com materiais de alta constante dielétrica para reduzir o volume ativo para um microlitro. As investigações de proteínas de cristal único requerem reduções de volume ainda maiores (menos de 0,03 µl) e isso exige uma abordagem radical. Para conseguir isso, Sidabras et al. combinou um microhelix auto-ressonante e um microcoupler planar em uma configuração de placa de circuito impresso, que impulsionou a microhélice auto-ressonante colocada no centro do laço de acoplamento. A geometria microhelix ofereceu vantagens com uma homogeneidade de campo de micro-ondas fortemente aprimorada e maior sensibilidade de volume para pequenas amostras em comparação com outros microrressonadores. A equipe otimizou o microhelix auto-ressonante para pulsos e experimentos de onda contínua que requerem muito pouca energia de micro-ondas. Eles combinaram e ajustaram facilmente o microhelix em uma variedade de amostras e temperaturas.

    No presente trabalho, a equipe usou a microhélice auto-ressonante para investigar a rotação do cristal EPR de [FeFe] -hidrogenase no estado oxidado ativo (H BOI ; dimensões do cristal 3 mm por 0,1 mm por 0,1 mm), a partir de Clostridium pasteurianum (bactéria anaeróbia). Eles realizaram experimentos avançados de EPR de pulso na estrutura para observar uma excelente relação sinal-ruído. Os dados demonstraram o uso da microhélice para estudar proteínas de cristal único em volumes apropriados para cristalografia de raios-X. Durante os experimentos, a equipe de pesquisa envolveu a geometria da microhélice auto-ressonante em torno de um capilar de 0,4 mm e conectou o conjunto a um inserto personalizado compatível com sistemas EPR comerciais. Eles conduziram um experimento EPR de onda contínua usando uma solução congelada e melhoraram a relação sinal-ruído (SNR) do trabalho usando um experimento de varredura rápida não-adiabática (NARS) de varredura de campo.

    EPR de onda contínua de cristal único de Y ∙ D no complexo do núcleo do fotossistema II. EPR de onda contínua coletado com a microhélice auto-ressonante de 0,4 mm de diâmetro interno em dois ângulos do radical do fotossistema II Y ∙ D de um único cristal a uma temperatura de 80 K. As dimensões do cristal foram de 0,3 mm por 0,18 mm por 0,18 mm. Mostrado em vermelho é uma simulação ajustada com recursos semelhantes. Um sinal de Mn2 + não especificamente ligado também está presente no licor-mãe do cristal, indicado por um asterisco (∗). Cada espectro foi coletado em 49 min com uma relação sinal-ruído de aproximadamente 35. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.aay1394.

    Eles usaram um radical tirosina D de vida longa (Y ∙ D) como uma sonda padrão durante experimentos com propriedades previamente bem caracterizadas. Para gerar o sinal EPR do radical tirosina (Y ∙ D), a equipe iluminou amostras do complexo central do fotossistema II (complexo de proteína de membrana) na luz ambiente e congelou-as rapidamente. Eles realizaram vários experimentos para demonstrar a versatilidade do microhelix durante as medições de EPR em uma variedade de amostras (menos de 85 nanolitros em volume) no X-band. Sidabras et al. usou os cristais do fotossistema II como referência, apesar de sua constituição desafiadora. Estruturalmente, o complexo do fotossistema II continha uma massa molecular de aproximadamente 350 kDa com cada componente contendo apenas um radical Y ∙ D. No total, com oito complexos do fotossistema II por célula unitária, os cientistas calcularam 8,9 x 10 12 Radicais Y ∙ D, demonstrar a versatilidade do método EPR para estudar grandes complexos em pequenas dimensões de cristal.

    Depois de estabelecer a adequação da microhélice auto-ressonante para estudar amostras de proteínas de cristal único, a equipe estendeu o trabalho para demonstrar a determinação total do tensor g angular (mudança de energia associada à transição molecular) e para examinar experimentos avançados de EPR de pulso, como modulação de envelope de eco spin de elétrons (ESEEM) ou correlação de subnível hiperfino (HYSCORE). Eles otimizaram o microhelix auto-ressonante para esses experimentos. A equipe realizou experimentos de EPR de ESE (eco de spin de elétrons) em um único cristal de proteína de [FeFe] -hidrogenase de C. pasteurianum (Cpl) no H oxidado BOI estado em uma câmara aneróbia sob um microscópio para absorver cristais de proteína por meio de ação capilar em um tubo capilar.

    Pulsar EPR em um único cristal do grupo H em [FeFe] -hidrogenase. (A) A estrutura molecular do sítio ativo da [FeFe] -hidrogenase, o H-cluster, do PDB ID 4XDC é mostrado com a estrutura molecular localizada com o ferro distal (Fed) como a origem. S, amarelo; Fe, laranja; N, azul; C, bronzeado; O, vermelho. (B) O esquema de simetria P1211 relacionando a estrutura molecular (x, y, z) para a moldura de cristal (a, b, c) e, último, para a estrutura do sistema de laboratório (L1, L2, L3) é mostrado. Os dois quadros moleculares da unidade assimétrica estão presentes no Site I e podem ser traduzidos para o Site II por operações de simetria de cristal. (C) O campo magnético estático (B0) é posicionado ao longo do eixo L1, enquanto o campo magnético de micro-ondas (B1) pode estar ao longo do eixo L2 ou ao longo do eixo L3. Uma rotação de 180 ° é viável em torno do eixo L3, mas apenas uma rotação parcial em torno do eixo L2 é viável por causa da rotação de B1 com o cristal, resultando em B1 para se tornar paralelo a B0. Uma terceira rotação parcial é viável se a amostra for girada 90 ° em torno do eixo L2. (D) Experimentos de EPR de pulso coletados com a microhélice auto-ressonante de 0,4 mm de diâmetro interno com um único cristal de [FeFe] -hidrogenase de C. pasteurianum (CpI) no estado Hox mostrando dados coletados em um plano para uma rotação completa de 180 ° em etapas de 5 ° a uma temperatura de 15 K. As dimensões do cristal eram de aproximadamente 0,3 mm por 0,1 mm por 0,1 mm, e cada espectro foi coletado em 8 min com uma razão sinal-ruído de aproximadamente 290. (E) Uma visão estéreo do tensor g analisado (gx, vermelho; gy, verde; e gz, azul) é mapeado na estrutura cristalina (PDB ID:4XDC). Para uma visão tridimensional (3D) do tensor g proposto, consulte https://act-epr.org/FeFeHydrogenase.html. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.aay1394.

    Eles então incluíram o crioprotetor e a mídia no microhelix seguido por congelamento instantâneo para produzir um sinal EPR com quatro sinais distintos no espectro em relação à estrutura da proteína. Os cientistas ajustaram os dados em simulações relacionadas a diferentes quadros de referência definidos por meio do pacote de simulação EasySpin para simulação de espectro EPR. A equipe criou um esquema relacionando a estrutura molecular do cluster H [FeFe] -hidrogenase H à estrutura do sistema de laboratório. Para todas as espécies examinadas nos experimentos, a equipe determinou a magnitude e orientação do tensor g usando a teoria do campo do ligante e verificou os resultados usando cálculos químicos quânticos. A equipe facilitou insights fundamentais sobre a estrutura eletrônica e observou sua dependência da esfera de ligante e observou a necessidade de estratégias otimizadas.

    EPR de HYSCORE de cristal único do grupo H em [FeFe] -hidrogenase. Superior esquerdo:Espectro ESE EPR de dois pulsos varrido em campo a 150 °. Os rótulos de figura (A, B, e C) são representativos dos picos espectrais. Os espectros HYSCORE coletados com a microhélice auto-ressonante de 0,4 mm de diâmetro interno de um único cristal de [FeFe] -hidrogenase de C. pasteurianum (CpI) no estado Hox em uma orientação de 150 ° coletados a uma temperatura de 15 K. O 2D a representação da densidade mostra correlações entre as transições de spin nuclear em ambas as projeções do spin eletrônico. (A) Limpe o espectro HYSCORE devido ao pico correspondente a apenas um dos sinais EPR na célula unitária do cristal. Os recursos correlacionados entre essas transições são indicados pelo branco, vermelho, e círculos verdes. (B) O espectro HYSCORE relativamente sem características sugere pouca interação hiperfina nesta orientação. (C) HYSCORE em dois sinais de EPR sobrepostos que representam diferentes orientações da molécula de enzima em relação ao campo magnético. O HYSCORE foi configurado usando o assistente Bruker HYSCORE com as seguintes configurações:π / 2, 40 ns; τ, 280 ns; and Δτ, 48 ns with 256 points each and 20 shots per point. Each HYSCORE spectrum was collected in approximately 1 hour. Crédito:Science Advances, doi:10.1126/sciadv.aay1394.

    The researchers illustrated more advanced experiments for single-crystal studies using HYSCORE (hyperfine sublevel correlation) experiments for the ESE (electron spin echo) EPR dataset. Por esta, they obtained a single-crystal 2-D spectrum for the H-cluster in [FeFe]-hydrogenase crystals and identified six main transitions. Sidabras et al. highlighted the feasibility of these advanced EPR techniques in the present work and related them to the electronic structure predicted using quantum chemical calculations. The team aim to address additional molecular couplings of ligands in depth using ESEEM/HYSCORE techniques in the future.

    Desta maneira, Jason W. Sidabras and colleagues presented an advanced resonator to design and collect EPR data from a 3 mm by 0.1 mm by 0.1 mm single crystal of [FeFe]-hydrogenase in the H OX state from C. pasteurianum (Cpl). The HYSCORE spectra obtained from a protein single crystal in the present work were a first in study. Additional work proposed by the team will facilitate further insight for protein engineering and artificial enzyme research to create bioinspired and biomimetic enzymatic systems. Notavelmente, the self-resonant microhelix engineered in the work can allow biochemists to study diverse catalytically active proteins at crystal dimensions relative to X-ray crystallography, which will pave the way for significant advancements in the field of enzyme research.

    © 2019 Science X Network

    © Ciência https://pt.scienceaq.com